纤维素酶.ppt

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1、纤维素酶概述,李昌灵B090201013发酵工程专业，生物工程学院 Dec.25,2009,内容,1 背景 2 纤维素及纤维素酶的介绍 3 国内外纤维素酶的研究热点,研究背景,能源危机 高油价，石油、天然气等化石燃料的枯竭,如石油大 约为11801510亿吨，大约在2050年左右枯竭，天然 气储备估计在131800152900兆立方米。年开采量维 持在 2300兆立方米，将在5765年内枯竭。煤的储量约为5600亿吨，可以供应169年。粮食紧缺 全世界饥饿人口：10亿纤维素乙醇 原料来源广:作物的秸秆(1.51012T/年)，大部分以焚烧的形式被处理掉，造成大量资源的浪费和环境污染。价格低：5

2、0美分/加仑（美国Novozymes公司）工业用酶的需求增大 酶的产值：1 1010美元/年,World energy usage width chart,汽油的价格,FLAG POLICY DURING THE 1973 oil crisis,1979 energy crisis,Line at a gas station,June 15,1979,全球粮食危机,粮农组织食品价格指数和农产品价格指数,Straws of Crop,纤维素的分子结构,分子量：1.51061.84106，相当于11 300个葡萄糖残基，这些纤维素分子以氢键构成平行的微晶束，约60个为1束。纤维素的弯曲模型:Her

3、mans(20世纪40年代)提出,纤维素(Cellulose)是植物细胞壁的主要组分之一,占植物秸秆干质量的40%50%。纤维素(Cellulose)：是由D-吡喃型葡萄糖基经-1,4 糖苷键联结而成的直链多糖直链状大分子纤维素折迭起来，形成具有高结晶的基本构成单位，由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位，再由很多的微小单位构成纤维素。,Figure 1 Hermans 式纤维素的椅式结构,纤维素酶的介绍,纤维素酶：指由生物产生的一种多组分的混合蛋白质，在适当的条件下，能使不溶性纤维素材料水解成可溶性糖的生物催化剂的总称。纤维素酶的结构,Fig.1 Model of cellulase

4、enzyme,produced by T.fusca(禾草腥黑粉菌),based on PDB structure 1JS4.,催化活性中心,到两个具有独立活性的结构域:具有催化功能的结构域(Catalytic domain,CD),具有结合纤维素功能的结构域(Cellulose binding domain,CBD),两者之间由一段高度糖基化的linker相连。整个分子呈楔形,球状核区表示包含催化位点和底物结合位点的CD区。少数没有CBD。,目前被阐明的催化结构域T.reeseiCBH的催化域结构,它是由/组成的筒状结构:由5个螺旋和7条链组成,活性部位由两个延伸至表面的环(loop)以形成

5、一个隧道状(tunnel)结构,长度大约2nm,包含4个结合位点,水解糖苷键发生在第2和第3结合位点之间。,纤维素酶的性状,真菌纤维素酶：以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素；细菌纤维素酶：形成多酶复合体结构又称纤维小体(Cellulosome)而起作用。能够更加彻底有效降解天然纤维素。,白色，溶于水，高温失活：最适温度在4565 之间，受二苯乙烯苷、葡萄糖酸-1,5-内酯等抑制,表1 产纤维素酶菌种的特点,纤维素酶的作用机制,纤维二糖酶,C1酶,C酶,根据酶的作用方式纤维素酶分为：,纤维素酶,C1酶：内切型酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于-（1，4)糖苷键，生成纤维糊精与纤维二糖。,C2

6、酶：外切酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于-（1，4)糖背键，逐步切断-(1,4)糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖(何明清，1994)。,Shoemaker、Goeran 和Jinshce等人相继发现，内切葡萄糖酶、纤维二糖水解酶及-葡萄糖苷酶均存在24 个同功酶，对于这些同功酶的功能，目前尚未见有明确的阐述，因此酶解机理还有待进一步研究和探讨。目前，已发现70种纤维素酶。,以上几种酶往往相互协同作用,Character of Reaction,Hydrolysis of 1,4-beta-D-glycosidic linkages in cellulose,li

7、chenin and cereal beta-D-glucans.,Fig.2 Character of Hydrolysis Reaction,纤维素的水解过程,Fig.3 Mechanism of cellulolysis,Breakage of the non-covalent in the cellulose,Hydrolysis of the individual cellulose it into smaller sugars,Hydrolysis of disaccharides and tetrasaccharides into glucose,纤维素酶的来源,真菌(mainl

8、y)：木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium），如 绿色木霉菌(Trichoderma viride),康宁木霉菌(Trichoderma koningii),黑曲霉（Asp.niger），绳状青霉、变幻青霉等.细菌:好氧菌：如纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、噬胞菌属（Cytophaga）厌氧菌：厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium）、产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白色瘤胃球菌（

9、R.albus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）等 超古菌：激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)等.放线菌:好氧放线菌(Actinomycetales)：生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)高温单孢菌属(Thermomonospora):弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)及假诺卡氏菌属等 植物、动物及原生动物(little):蜗牛(snail),蟑螂(cockroaches)等.,纤维素酶的应用：,纤维素酶,食品生产,医药,生物燃料,造纸,洗涤剂,纺织工业,针对以上不知，国内外研究主

10、要集中在以下几方面:,1、菌种选育：构建表达具有较高酶活力的纤维素酶菌株;2、酶功能的改造：通过分子改造来提高酶的功能性;3、通过低成本发酵来生产酶制剂：添加可溶性诱导剂，如槐糖(sophorose),纤维二糖(cellobiose),乳糖(lactose)和寡糖(cellooligosaccharides),纤维素酶在实际应用的不足,(1)技术上：纤维素酶对温度、湿度、酸碱度十分敏感,生产 纤维素酶在保管、加工等过程中处理不当就会失活,影响应用效果。(2)标准上：纤维素酶的质量标准、校验方法标准,特别是添加纤维素酶后的产品质量标准,在我国还是空白。,取得的成效与预期的目标相距甚远,原因主要有

11、2个：,今后对纤维素酶的研究会重点集中在:,纤维素酶高产菌株选育：对菌株进行改造,提高菌株生产能力及酶的活性和稳定性，筛选极端条件下纤维素酶高产菌株优化发酵条件：改进发酵工艺,降低生产成本,使发酵产物易于分离纯化。纤维素酶的测定方法规范化：包括规定标准菌株、标准测活方法、标准底物等。,纤维素酶研究现状,Bok JD.等人从Thermotoga neapolitana中分离纯化到2个高热稳定性内切纤维素酶CelA、CelB,编码这2个内切纤维素酶的基因已经被鉴定。Bronnenmeiar将一种来源于T.maritimaMSB8的高热稳定性外切纤维素水解酶,最适温度为95,pH在6.07.5,该酶

12、能水解微晶纤维素、羧甲基纤维素和-葡聚糖形成纤维二糖和纤维三糖。来自S.solfataricusMT4的-糖苷酶已被纯化鉴定,该酶是一个同源四聚体,85以上对各种变性剂有极高抵抗力。编码该酶的基因已在大肠杆菌中克隆和高效表达。用拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片、马铃薯或烟叶来表达热稳定性好的Acidothermus cellulolyticus endoglucanase E1。,1987年,Love在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆了最适生长温度为65的极端嗜热厌氧菌（Caldocellum saccharolyticum）的-葡萄糖苷酶,并完成测序。1996年Bergqu

13、ist克隆的栖热菌耐热纤维素酶的耐热温度为70。1997年美国RB I公司开发的103酶耐热温度100,最适酶促温度7080。1998 年THOMAS克隆到Streptomyces viridosporus的内切纤维素酶基因并成功表达于Pichiapastoris 中。2000年 SPIRIDONOV尝试用放线菌（Thermobifida fusca）进行体外合成纤维素酶，发现这一过程受celR 基因调控。通过对比celR 基因突变型与野生型的差别，发现celR 为组成型表达基因，其DNA 结合活性受翻译后修饰调控。2001年VAN Solingen从湖底淤泥中筛选到了生产碱性纤维素酶的放线菌

14、菌株，经16S rDNA 测序，初步鉴定为链霉菌属新种，并成功克隆到了纤维素酶基因cel12A，并将其利用大肠杆菌表达。,纤维素酶的生产,液态发酵,固态发酵,生产方式,胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶，结果为：木霉和黑曲霉按4:6同时接种，在84h产纤维素酶活力达到230IU/g干物质，木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质，与两菌纯培养相比，纤维素酶活力提高163%，木聚糖酶活力提高79.5%。,邹水洋等对选育的一株康宁木(Trichoderma koningii)QF202进行液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶.通摇瓶培养144 h后，滤纸酶活1.49 FPU/mL、-葡

15、萄糖苷酶活0.39 U/mL、木聚糖酶活174.10U/mL.比一种商品纤维素酶的糖化能力及总还原糖产量比商品纤维素酶分别提高了55%和40%,葡萄糖产量分别提高了33%和12%.,纤维素乙醇的生产工艺,pretreatment,Cellulose material,cellulolysis,sugar solution,fermentation,Distillation,Dehydration,95%alcohol,over 99.5%ethanol,cellulase,纤维素生产乙醇及其他化工产品的关键,纤维素的糖化的主要方法酸水解法：酸水解法中，稀酸水解所得糖化率低，高浓度强酸可有效水解

16、纤维素，但其腐蚀性对人体有害，且所需工艺条件苛刻。酶水解法：用纤维素酶水解纤维素，在常温、常压条件下就可以.因此，用纤维素酶降解纤维素是目前纤维素利用研究中的热点。稀酸预处理-酶解法：美国可再生能源实验室开发的发酵工艺,参考文献：,1 Ziegler M T，Thomas S R，Danna K J.Accumulation of a thermostable endo-1,4-D-glucanase in the apoplast of Arabidopsis thaliana leaves J.Mol.Breed.，2000，6：37-46.2 Dai Z Y，Hooker B S，And

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