细胞治疗用无血清培养基ppt.ppt

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1、细胞治疗用无血清培养基国内外现状,邵 宁 生,CIK 和 DC细胞,CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止

2、癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。DC(树突状细胞)：一个独特的调控初始免疫反应的白细胞群落。,免疫细胞培养的一般操作步骤,CIK细胞培养：1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）；或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37C的水浴，快速解冻（1分钟）冷冻小瓶的外周血单个核细胞2、用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5的热灭活的的人自体血浆。3、计数细胞可以使用电子（即Coulter计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球计数仪）。4、离心细胞，清除洗涤缓冲液。5、培养初期，用含细胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC

3、；CD3+T细胞密度保持在大约0.5-110 6/mL。转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶）。随后可应用各种操作激活T细胞，包括添加刺激的抗体或抗原抗原呈递细胞。无论培养T细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。6、在37，5CO 2的潮湿培养箱。在潮湿的气氛中，在37C，5CO2孵育培养容器。在对数生长期细胞，需要维持细胞所需的浓度。为了保持细胞指数生长期，当细胞密度超过110 6/mL时，需要分离传代，维持细胞密度在0.5-110 6/mL（例如，210 6个细胞/mL以上，按1:4比例0.5x106细胞/mL）。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不超过1

4、到1.2厘米。,免疫细胞培养的一般操作步骤,单核细胞树突状细胞(DC)培养：1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基。3、在37，5CO 2的潮湿培养箱中孵育23小时。4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14+单核细胞）三次。6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng/mL的重组人IL-4和50 ng/mL的重组人GM-CSF。细胞密度应介于13x105细胞/mL之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。7、在37，5CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添加

5、IL-4和GM-CSF。8、6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。9、向培养基中添加1g/mL的LPS或者50l/mL的TNF-诱导的树突状细胞的成熟。,CIK、DC-CIK细胞无血清培养基,标准：可用于免疫细胞临床治疗研究的无血清培养基，生产过程符合cGMP的标准规范。可用于人类体外 组织及细胞培养。有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培 养基批间差异小，培养条件容易保持一致，实验 的重复性大为提高。使细胞大量增殖、不分化。,常用国外公司产品,LONZA的X-VIVO TAKARA的GT-T551 都是非常好的无血清培养基

6、，适合CIK、DC-CIK的培养都可用于临床。,LonzaX-VIVO培养基说明书Lonzas的努力和许多临床实验的合作已经证明lonza有条件和技术推进免疫、癌症、基因和其他细胞治疗的发展，lonza的宗旨就是用无血清组分在细胞治疗中为细胞提供一个营养全面和平衡的环境，这里面不含任何外源性生长因子，细胞增殖人工刺激物或者不确定成分。这个产品避免了任何蛋白激酶c刺激物，适用于人类和鼠淋巴细胞第二信使激活的研究，成分完全包含药用级的人类白蛋白、重组人类胰岛素和经巴氏消毒的人转铁蛋白。所有X-VIVO培养基都是在目前GMP条件下生产，并且通过FDA认证，查询认证可联系产品经理。,-查,-查,宝日医

7、生物技术(北京)有限公司Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.,GT-T551产品特点:日本原装进口无血清培养基，适用于人体淋巴细胞及DC细胞培养。日本原装进口无血清培养基，已经加入人血白蛋白组分 支持淋巴细胞的高密度细胞培养 在日本多家医院用于临床治疗的细胞培养 配制用水符合国家药监局人体细胞治疗研究和制剂质量控制指导原则中注射用水标准,国内公司产品,百恩维人免疫细胞无动物源培养基经过测试对比，百恩维的免疫细胞无动物源培养基质量远优于进口培养基，细胞增速、支持免疫细胞Marker、杀伤能力等技术指标更胜一筹。1、百恩维免疫细胞无动物源培养基

8、(产品号：BW12002,1000ml)的特点适用范围广：适用于人体各种免疫细胞的无动物源培养。培养性能优越：支持高密度细胞培养。可维持细胞的高杀伤力。质量保证：按cGMP标准生产，配制用水符合国家药监局人体细胞治疗研究和制剂质量控制指导原则中注射用水标准。,百恩维生物科技有限公司（Biowit Technologies）(深圳南山科技园)，是一家专业从事生物科技前沿技术研发的高新技术企业。为国内外众多药厂和科研机构提供病毒包装，蛋白表达，载体构建，干细胞培养基，转染试剂、细胞因子等产品及技术服务。公司专家团队曾在国内外知名学府和国际一流制药公司从事研发多年。,天津美德太平洋科技有限公司,-C

9、IK无血清细胞培养基:由天津美德太平洋科技与美国斯坦姆再生医学研究开发中心共同合作利用人造血浆技术开发的新一代拥有自主知识产权的美德斯坦姆无血清细胞培养基系统可有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培养基批间差异小，培养条件容易保持一致，实验的重复性大为提高。培养基与试剂的成分，都经过仔细地筛选，并且符合或超越最高规格国家执行标准。成品试剂成分均达到或超过中国药典的标准。产品特点：1.同美国斯坦姆再生医学研究开发中心共同研发，并由其监控产品 质量；2.开瓶即可使用的完全培养基，即可用于滋养层培养法，也可用于无滋养层 培养法；3.最新配方，支持胚胎干细胞及诱导胚胎干细胞快速贴壁并大量增殖；不含

10、 异源动物成份可有效避免人畜共染疾病问题4.与同类产品相比，含有更低浓度的bFGF和TGF因子，不干扰细胞代 谢，不刺激细胞分化。,存在的问题及我们的思路,存在问题：国外产品价格昂贵，国内效果不佳。医院大都使用有血清（胎牛）培养前几代，增殖到一定数目后再用无血清培养基培养2-3代，洗涤后生理盐水分装。我的建议：第一阶段：参照目前方法第二阶段：购买品牌无血清培养基第三阶段：改进型或自主创新型培养基,CIK细胞、DC-CIK细胞培养基基本成分,CIK细胞培养：1640培养基，不同时间加入终浓度为1000U/ml的INF-,IL-1（终浓度为100U/ml）、IL-2（终浓度为1000U/ml）和C

11、D3单克隆抗体（终浓度为50g/ml）。DC-CIK培养：用1640培养基GM-CSF、IL-4、LPS、TNF-、IFN-、CD3-McAb、rh-IL-2,相关研究,BMC Biotechnol.2010 Sep 21;10:70.doi:10.1186/1472-6750-10-70.Development of a serum-free medium for in vitro expansion of human cytotoxic T lymphocytes using a statistical design.Jeon MK,Lim JB,Lee GM.RESULTS:From a

12、 statistical analysis using the fractional factorial method,cholesterol and polyamine supplement were identified as positive determinants for cell growth.Their optimal concentrations were determined by the response surface method.The maximum viable cell concentration in the developed SFM was enhance

13、d by more than 1.5-fold when compared to that in RPMI1640 supplemented with 10%fetal bovine serum(FBS).Furthermore,a cytotoxicity assay and an enzyme-linked immunospot assay revealed that the effector function of cytotoxic T lymphocytes generated from PBMCs grown in SFM,by stimulation of peptide-pre

14、senting dendritic cells,was retained or even better than that in SCM.CONCLUSIONS:The use of a developed SFM with cholesterol and polyamine supplement for human lymphocyte culture resulted in better growth without loss of cellular function when compared to SCM.,相关研究,Zhongguo Fei Ai Za Zhi.2010 Apr;13

15、(4):277-81.doi:10.3779/j.issn.1009-3419.2010.04.01.Biological characteristics and antitumor activity of CIK cells activated by recombinant human fibronectin for human lung cancer cell lines in vitro.Article in ChineseWang S,Du W,Zhang H,Wulan T,Zhang Y,He Y,Yang Y,Liu S,Zhang Z,Wang J.SourceDepartme

16、nt of Biotherapy,Fourth Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110032,China.RESULTS:The RN-induced group had a higher proliferation rate that was 2.0-3.5 times of the conventional group,and there was an obvious statistical difference between the two(P 0.05).We found a similar inhib

17、ition rate of the CIK cells to all this human lung cancer cell lines(P 0.05).The cells which secreted IFN-gamma increased,while the cells which secreted IL-4 did not.The cells which secreted granzyme B and perforin were positive.CONCLUSION:It is an effective and simple way to cultivate the CIK cells

18、 with RN,which should be adopted.,中国肿瘤生物治疗杂志 2012年03期 加入收藏 获取最新 两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征郑秀娟 刘荣军 李丽 张一评 汪强【摘要】：目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-、IL-12和anti-CD3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononucle

19、ar cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至200倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-分泌明显高于NK培养基组(724.7434.8)vs(108.960.6)pg/ml,P0.01;而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16

20、+CD56+细胞比例高于CIK培养基(6.273.33)%vs(2.881.88)%,P0.05。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。【作者单位】：上海复仁生物科技有限公司;,硕士毕业论文,无血清培养DCs激活的CIK治疗肝癌的体外实验研究论文摘要:目的:1.建立一套高效的无血清体外制（略）的方法,为DCs疫苗的临床应用提供实验依据.2.探讨DCs对CIK增殖和杀伤肝癌细胞的影响.方法:1.采集脐血,分离其中的单个核细胞,用无血清DCs培养基(SFM)/含（略）的RPMI-1640培养基(SM),并添加rhGM-（略）IL-4联合诱导

21、单个核细胞分化为未成熟DCs,第5天添加肝癌细胞冻融抗原,TNF-等促成熟因子,第7天收获成熟DCs,以倒置显微镜观察DCs的细胞形态,流式细胞仪测定Des表面标志物的表达;并从细胞形态和（略）方面比较用无血清DCs培养基(SFM)/含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基(SM)培养的DCs.2.用细胞因子-IFN、IL-2、CD3-Ab、IL-1a诱导脐血单个核细胞为CIK,第7天DCs和CIK共同培养.采用MTT法（略）养基和含5%胎牛血清的培养基产生的DCs刺激CIK的促增殖效应和DC-CIK对肝癌细胞的杀伤效应.结果:1.无论采用无血清树突状细胞培养基(SFM)还是含5%胎牛血清的R

22、PMI-1640培养基,脐血来.,间充质干细胞（MSC）培养,人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混匀后，保存于4冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培养液）混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平离心机20条件下500g（2000r/min）离心2530分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤23次后，加适量培养液计数。（3）数细胞数量，达到106107/ml后即进行原代培养，按5106/ml 浓度接种于50ml培养

23、瓶中（1106/cm2培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每34d半量换液1 次，1012d细胞达90%融合时传代。（4）传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+、Mg2+PBS液洗涤二次，加入37 预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化12分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，

24、1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞再悬浮于培养液中，按25105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓 MSC。传至35代的MSC按1105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。,贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。,间充质干细胞（MSC）培养基,目的是人间充质干细胞(hMSC)生长和扩增有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培 养

25、基批间差异小，培养条件容易保持一致，实验 的重复性大为提高。使细胞大量增殖、不分化。,STEMPRO hESC SFM人间充质干细胞培养基 STEMPRO hESC SFM第一款无血清培养基(SFM)，专为人间充质干细胞(hMSC)生长和扩增而开发出众的扩增效率 更高品质的人间充质干细胞 更佳的批间一致性第一种适合 hMSC 的无血清培养基在高细胞密度下实现高效 hMSC 扩增 需要较少的培养基、表面积，节省时间 更优质的细胞 传代 5 次之后仍具有原始表型，保持 hMSC 表面标志物表达，具有正常的基因表达谱，并且保持 CFU-F 和三系中胚层分化能力 批间一致性高-在 cGMP 条件下生产

26、，通过 hMSC 性能分析进行认证 无需或仅需少量驯化，即可从添加血清的培养基改为使用此产品高细胞密度下的优异 hMSC 扩增扩大 hMSC 的产量对于任何活细胞治疗而言都至关重要。采用STEMPRO MSC SFM可实现100万至10亿个hMSC细胞的扩增，与经典培养基(DMEM+10%MSC经过质量认定的FBS)相比，培养基用量减少85%，表面积减少92%，时间缩短16%，传代次数和精力减少25%(反应板用量和传代次数减少，无需预先经过认证的FBS)(表1),Invitrogen,CELLstart-适用于无血清 hMSC 的培养基质 CELLstart可与STEMPRO MSC SFM配

27、合使用，当hMSC细胞在无血清条件下培养时，用以支持hMSC细胞的粘附。CELLstart是第一款无外源成分基质，可用于干细胞的培养，其按照cGMP要求生产，批间品质一致。,Invitrogen,GIBCO A10332-01 间充质干细胞无血清培养基StemPro MSC SFM,Developed for Human Mesenchymal Stem Cell CultureStemPro MSC SFM is a serum-free medium(SFM)specially formulated for the growth and expansion of human mesench

28、ymal stem cells(MSCs).StemPro MSC SFM enables superior human MSC growth and increased consistency compared to classical serum-supplemented medium(DMEM+10%FBS).Using StemPro MSC SFM,human MSCs can be expanded beyond 5 passages while still maintaining their tri-lineage mesoderm differentiation potenti

29、al(i.e.,ability to differentiate into osteogenic,chondrogenic and adipogenic lineages).Each lot of StemPro MSC SFM is qualified using a human MSC performance assay and human MSCs growing in serum-supplemented medium can be transitioned directly into StemPro MSC SFM with little or no adaptation requi

30、red.In addition,StemPro MSC SFM facilitates expansion of MSCs directly from primary human bone marrow.For human ex vivo tissue and cell culture processing applications.CAUTION:Not intended for direct administration to humans or animals.,人脂肪间充质干细胞无动物源培养基百恩维的人脂肪间充质干细胞无动物源培养基根据人脂肪间充质干细胞的生长需要，培养基包含必需和非必

31、需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质以及其他补给成分。非常适用于培养人脂肪间充质干细胞。产品严格无菌，无病毒和支原体，性能稳定，使用该培养基能使人脂肪间充质干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化（至少10代以内）。产品货号BW110025,人间充质干细胞生长无血清培养基,LONZA 00190632 MSCGM-CD BulletKit 人间充质干细胞无血清培养基评价或评论上海华雅思创生物公司销售的TheraPEAK Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基是从

32、美国原装进口的，由美国LONZA公司旗下的BioWhittaker公司专门针对人间充质干细胞(MSCs)研发的特定细胞培养基。美国BioWhittaker公司作为美国最早的人体和动物细胞培养基的供应者，进入生物医药已有50年的历史（1952年成立）。美国BioWhittaker公司的细胞培养产品主要有特定细胞的原代细胞生长培养基，通用无血清培养基，特殊用途无血清培养基，普通培养基，无蛋白和限定化学成分培养基等细胞培养基类产品和内毒素检测试剂盒等生命科学产品。1997年美国BioWhittaker公司成为美国Cambrex公司旗下子公司，继续服务于欧美及全球生命科学市场。为了研发更多优质产品，2

33、007年BioWhittaker公司加盟LONZA集团，同时LONZA集团为其BioWhittaker子公司提供了雄厚的资金和高端的技术支持。为此，LONZA品牌的细胞培养类和内毒素检测类产品将以更优异的产品质量和便捷的服务提供给广大用户。LONZA TheraPEAK Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基已经在欧美及中国科研市场广泛使用多年，具有在高细胞密度下实现高效 hMSC 扩增；人间充质干细胞(hMSCs)传代5次之后仍具有原始表型，保持hMSC表面标志物表达，具有正常的基因表达谱，并且

34、保持CFU-F和三系中胚层分化能力；在cGMP条件下生产，通过 hMSC 性能分析进行认证，保证极小的批间差；无需或仅需少量驯化，即可从添加血清的培养基改为使用此产品。上海华雅思创生物科技有限公司在上海仓库备有少量现货，并严格按照产品的最佳储存条件进行储存与管理，我们的一贯宗旨是：更用心地为中国广大科学研究工作者提供更安全、更放心、更便捷的服务。欢迎您来咨询与购买LONZA TheraPEAK Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基！,人间充质干细胞无血清培养基-上海依科赛生物制品有限公司注明研究

35、用，不能用于人的诊断与治疗,存在的问题及我们的思路,国内外品牌宣传的好，其实效果不佳，不能从开始做到无血清培养，细胞扩增。国内有些无血清配方添加生长因子，如FGF，能扩增，但是引起细胞分化。国内医院都是前期有血清培养，后期洗涤细胞，生理盐水分装。第一阶段：参照目前方法或改进型第二阶段：自主创新真正意义上的无血清培养。,J Clin Immunol.2011 Dec;31(6):1143-56.doi:10.1007/s10875-011-9581-z.Epub 2011 Sep 2.Immunomodulative efficacy of bone marrow-derived mesench

36、ymal stem cells cultured in human platelet lysate.Flemming A,Schallmoser K,Strunk D,Stolk M,Volk HD,Seifert M.SourceInstitute of Medical Immunology,Universittsmedizin Charit,Campus Virchow Klinikum,Augustenburger Platz 1,13353,Berlin,Germany.AbstractHuman mesenchymal stem cells(hMSCs)are considered

37、to be a promising tool for novel cell-based therapies.Clinical applications in solid organ transplantation were hampered by the dependence on animal serum for hMSCs clinical scale expansion until substitution with human platelet lysate(HPL)became a promising alternative.Therefore we focused on a dir

38、ect comparison of immunomodulatory properties of hMSCs cultured in HPL or fetal calf serum(FCS).Phenotypic characterization,detection of cytokine secretion and effects on alloantigen-and mitogen-induced lymphocyte proliferation as well as degranulation of cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells w

39、ere applied in potency assays.We demonstrated that HPL-cultured MSCs have comparable immunomodulatory capacities to their FCS-cultured counterparts.The observed immunomodulatory properties include a beneficial inhibitory effect on immune cell proliferation and an unaffected viral T cell immunity.Thus,culturing hMSCs in HPL generates an efficient and safe expansion combined with intriguing immunomodulatory properties making these cells an attractive cell therapeutic tool.,