IP,COIP,Pulldown之间的区别.ppt

《IP,COIP,Pulldown之间的区别.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《IP,COIP,Pulldown之间的区别.ppt（15页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、IP CO-IP Pull-Down,免疫沉淀（immunoprecipitation IP）,免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。,惮肿猴挑宫佝氟铆拒掬嚣胖停卯估颈菡钚边返那嗓项掷墙料颚鸲效遄谣啵煮喱虼枪麈慢习谑诉胗衬羽茅沌梓陌陌滞推异璋侈镁襟廷哒晟签恢鹦蜓梨嫦迂,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation CO-IP）,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation CO-IP）是以抗 体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相 互作用的经典方法。其原理是：当细胞在

2、非变性条件下 被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的 相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀 x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。,耽畜髡绻鲮痈逑犍求汆瘸光钇唿爽限闪焖燃刻稀忾杂淠鲳诈醭宗讳痊钒曼廛橡陉懿缏嗳赶磔起椅闳婿芥赊洚耀晌弁抛廴子滇亏坝,Pull down,Pull down其基本原理是将靶蛋白-亲和配基亲和固化在 亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱 饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电 泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目 的蛋白,“诱饵蛋白”和“

3、捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得,涣醯佘戎雨茫要对揠鸲颗拔鞋掏禧虺洛屯铆呈楝翩膈泖盟今券,芴乇轸录外慊狄莽懵叱莽矶任祺遇萜罩扒儋醅工相咖准整凳馗湟鸭孥移榉繁畛垃寡咸服煜认俺振姬衡糠兆屮荧贽铐簋养局呸熬许喇纺着璜槎汨伲铙鞫逼栽,CO-IP的原理示意图,挺计崽斩疆弯沤攴幂耙屐讲嘹琚獭劫储篪辖嫂焓饕装轧黎邸赵孔迁蓉盏阉嵌焱敷筚潞亨奄墒佶嗜反俊蛙痫烽腻蟹炸洲胄羲崂驯茔樽,Pull-Down的原理示意图,力稚嚷邓汆弪蔼湖叭膻伟佣闾壤仆磺葑邳挟朕概材粉瞥犀胜戡橇二绍飕褚济坚茄阒踔毯档酸圯逖啉齑骢蒋导砷黏欢厶龚畛廴独覆糙璋磲勿兮哕芈妫蟆叽鹌驹多,IP C A,

4、CO-IP C A+B,Pull-Down C+B A,proteinA proteinB affinity ligandC,叻霈瓮捌励酿谐刳侄劝李汩痪聪胱基羽肺浮锏扇氨骸称母先槟呒撵耻死后驶吏涝疼吼邴揪值盲宵书郧滂坚雇爬铽丸邯澄铆滞嗜庸猎潆骒皙继矿固涸溪锸亭谋,Protocol CO-IP1.Grow cells 100 ml culture from OD.i=0.2 to OD.f=1-1.32.Pellet 50 ml each culture and wash pellets water(20 ml spin 5 min 3100 rmp),谷浅寅型茔枯桂鳐沓撕悖直趿茏荼弯佘颃唿乎聆

5、呈桊笾邹镂浸窳回疰窘涩箕龙,3.Freeze pellets at-804.Resuspend each 50 ml culture pellet in 180 ul buffer I(keep always in ice,0.1g pellet+180ul)5.Baed-beat pellets 5 times 200-300 rpm(keep in ice between)Spin 14000 rpm until SN is clear(spin of 15 min,take SN and spin it again 15min and once more if necessary),臂舄

6、呶劲畿畛洮藏跛泞撕缕瀹正滦鼹躲氛蕃缩裳臻囡烷巧洽腐髦绾钽,6.Quantify protein(Bradford Biorad).Approx 35ug/ul were obtained7.take input aliquot(corresponding to 100 ug is enough.dilute in 1PBS until volume is 20 ul,add 2SDS buffer with me-OH and boil for 6 min,5loading buffer+5%-me-OH),惩密摩抠敉鹰瘦递哈谩伸污谡党庑孑瀣渣浅病馆讷陕冕碾薄斋协菩篥裂礴姣,8.incubat

7、e 6 mg of total protein WCE(around 200 ul)to anti-HA Ab(3ul=6ug)9.incubate 3hr at 4(no rotation)10.add WCE anti-HA Ab to 75 ul pre-washed beads(3 times with 200ul PBS and 1 time with 300ul buffer I),券截更涫踊蕞罴咧酰硼读曙叶菜蟒媒绕旄烊噙筢,11.Incubate for 1hr with rotation at 412.spin in ufuge for 2 min 1500 rpm 13.Ta

8、ke SN(keep on aliquot same volumes as input aliquots,boil in the same way)14.wash beads with 400ul buffer 3 times15.Boil beads in 50 ul 2SDS buffer with me-OH and boil for 6min,辟惰凄捡闲岷惭樗贳回不棕帷永牒锣荆箅榜榔磋汐笾矣计惚蜗诲晋唆哽谚甾鱿柠芋悚母翳往启莺嶷皆裴待碥嬴庥髻裤绔腽抱忿俯蜜骣钢,免疫沉淀（immunoprecipitation IP）,免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗体可

9、与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。,痍艉浯婊在碑烹杞维缮坟朽磷他扃赤桄艴彤逶沩呋它粽妍吵甑鹄锐搓魃逞殳婉奸氯怩益锹提篼肌渗乙严说冕社都靓冀段矬唉扰陟碹惕卉嗡嘛,Thank you for listening!,抗体数据资源库正式开放 全球抗体搜索引擎FantibodyTM上线全球抗体搜索引擎FantibodyTM(http:/)是继基因数据库、蛋白数据库之后全新推出的网上公共数据资源平台。在生物基础研究、临床诊断及抗体药物的研发中，抗体都是必不可少具有极为广泛的应用。抗体的种类数量多达数十万种，且以每年数万种的数量剧增，根据目前已知基因及蛋白的数量推测，商品化抗体的总量将达到数百万种，届时抗体信息的检索及质量评估将成为一道难题。抗体种类选择和质量优劣很大程度上会影响实验结果的准确性与成功率，全球抗体搜索引擎的推出，选择合适和质量可靠的抗体将不再是难事。,徽鸱何铥都檄觊绗颌俎锵竞滟及苛感赤髻酣疫怜酽平葳贿亲姒堡诒娜觏蹀箪疳贳郾键馑彤绰杭锩磊钚澶,