氨基酸生产.ppt.ppt

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1、25 氨基酸发酵工艺,25.1 概述25.2 氨基酸发酵的代谢控制25.3 氨基酸发酵的工艺控制25.4 谷氨酸生产工艺25.5 赖氨酸生产工艺简介,25.1 概述,近40多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由20世纪60年代50种左右，发展到20世纪80年代的400种，目前已达1000多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸。氨基酸中有8种氨基酸人体本身不能合成，只能从食物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是L-赖氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮

2、氨酸、L-苯丙氨酸和L-蛋氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。,25.1 概述,25.1.1氨基酸的应用 1、食品工业：营养强化剂；鲜味剂；甜味剂。2、饲料工业：营养强化剂。3、医药工业：氨基酸输液；氨基酸衍生物；氨基酸盐。4、化学工业：洗涤剂；护肤品；人造革。5、农业：无公害农药。,25.1 概述,氨基酸的应用食品工业：强化食品：谷物中缺赖氨酸，苏氨酸，色氨酸、蛋氨酸。增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸。甜味剂：苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,25.1 概述,氨基酸的应用食品工业：大豆蛋白的氨基

3、酸组成影响其营养效价。,25.1 概述,氨基酸的应用医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。,25.1 概述,氨基酸的应用饲料工业：不可缺少的营养性添加剂，一般生长期添加赖氨酸，产蛋期添加蛋氨酸，饲料配制时必需计算氨基酸平衡。,25.1 概述,氨基酸的应用化学工业十二烷基谷氨酸钠肥皂-无皮肤刺激洗涤剂焦谷氨酸钠-润肤剂聚谷氨酸人造革、人造纤维和涂料,25.1 概述,氨基酸的应用农业特殊的氨基酸农药如N-月桂酰-L-异戊氨酸，能防治稻瘟病，又能提高稻米的蛋白质含量。氨基酸烷基酯及N-长链酰基氨基酸能提高农作

4、物对病害的抵抗力，具有和一般杀虫剂一样的效果。,25.1 概述,25.1.2氨基酸的生产方法 1、发酵法（1）直接发酵 第一类用野生菌株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸。第二类用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸缺陷型生产赖氨酸；酪氨酸缺陷型生产苯丙氨酸；苯丙氨酸缺陷型生产亮氨酸；亮氨酸缺陷型生产缬氨酸。,25.1 概述,氨基酸的生产方法 第三类用抗氨基酸结构类似物突变株，如利用乳糖发酵短杆菌 的S-(2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC,赖氨酸结构类食物）抗性菌株生产赖氨酸。利用黄色短杆菌的5-甲基色氨酸（5-MT，酪氨酸结构类似物

5、）抗性菌株生产酪氨酸。第四类抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株，如利用乳糖发酵短杆菌的抗AEC腺嘌呤、鸟嘌呤缺陷型生产赖氨酸。营养缺陷型回复突变株发酵。,（2）添加前体的发酵：通过添加氨基酸的前体或中间产物，以避免生物合成途径中的反馈抑制，如以吲哚为前体，利用麦角菌生产色氨酸。,25.1 概述,氨基酸的生产方法 2、酶法：利用酶来制造氨基酸。应用完整菌体或从微生物细胞抽提的酶类合成氨基酸。天冬氨酸已于1973年应用完整菌体固定化进行生产，这是世界上最早应用固定化菌体的例子。赖氨酸、色氨酸、丙氨酸也可以生产。,25.1 概述,3、提取法：蛋白质水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。4、合

6、成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸，蛋氨酸和甘氨酸现在仍大量应用合成法。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。近年来，由于微生物代谢调控理论的研究，使得大部分氨基酸得以发酵生产。,25.1 概述,25.1.3氨基酸的国内外生产概况 日本和德国为世界主要氨基酸生产国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,25.1 概述,氨基酸的国内外生产概况 国内生产主要氨基酸生产厂：天津氨基酸公司、湖

7、北八峰氨基酸公司 生产规模及产品质量与国外大厂有较大差距。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术，1991年销售量为二千万瓶，1996年达六千万瓶，主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。,反馈调节作用,1、终产物反馈阻遏和反馈抑制 野生型菌株“A”氨基酸合成操纵子模型,AR,P,O,A结构基因,无活性repressor,A,RNA聚合酶,反馈阻遏,活性,A合成酶系（E1,E2）,A,反馈抑制,超过生理需要量,野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏,25.2 氨基酸发酵的代谢控制与育种,野生型菌株酶活性水平的反馈抑制,过量A作

8、用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活,Gene编码酶,效应物位点 过量A,酶活中心,反馈阻遏与反馈抑制比较,2、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育,野生型菌株,诱变,解除反馈调节突变株,AR-或AO-,AR-AO-,酶基因突变,解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物筛选方法：解除Lys反馈调节突变株筛选,野生型菌株,诱变,菌细胞,正常反馈调节型,解除反馈调节突变型,25.2.1 氨基酸生物合成的调节机制,25.2.1.1反馈抑制与优先合成,反馈抑制,反馈阻遏,氨基酸生物合成调节机制的基本模式,25.2 氨基酸发酵的代谢控制与育种,25.2.1 氨基酸生物合成的调节机制,氨基酸生物合成

9、的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分支点处的优先合成。反馈控制机制如上图，催化合成途径最初反应AB的初始酶受终产物E的反馈抑制，同时，合成途径上各种酶的合成受终产物E的阻遏。,25.2.1 氨基酸生物合成的调节机制,在途径分支点处优先合成的调节机制如下图，在分支点后，其中的一个终产物E优先合成，优先合成的关键酶，即催化CD反应的酶受E的反馈控制，催化AB共用酶受第二个终产物G的反馈控制。首先，E比G优先合成，E过剩时，反馈抑制CD反应的酶，转换为合成G。G过剩时，催化AB反应的酶，就会为G所控制。假如人为让特定氨基酸如G过剩，就会因E的合成不足而影响细菌生长。,25.2.1.1其他特殊的控制

10、机制1.多终产物控制 催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况：,协同（或多价）反馈抑制：协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式,合作（或增效）反馈抑制：系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。,同功酶控制：同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。同功酶的主要功能在于其代谢调节。在一个分支代谢

11、途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用而不致过剩,积累反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。,2、顺序反馈抑制：当E过多时，可抑制CD，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了CF，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对AB间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制,顺序控制：,A,B,C,D,E,F,G,A,

12、B,C,D,3.平衡合成：,经分支合成途径生产两种终产物E和G，E和G取平行合成。E优先合成，E过剩时，反馈控制与优先合成有关的催化CD的酶，转而合成G。G过剩时，可逆转E的反馈控制，即E的反馈控制为G所抑制，又转为优先合成E。,B,C,D,E,F,G,4.代谢互锁：从生物合成途径看，是受一种完全无关的氨基酸的控制。它只是在很高浓度下（与生理学浓度相比）才能体现抑制作用，而且是部分性的抑制（阻遏）作用。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制与育种,1、控制发酵的环境条件 氨基酸发酵受菌种的生理特性和环境条件的影响，对专性需氧菌来说环境条件的影响更大。谷氨酸产生菌因环境条件的影响会引起发酵的转换，生成

13、各种不同的产物。,25.2.2生产中代谢控制的措施,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,溶解氧：乳酸或琥珀酸谷氨酸酮戊二酸（通气不足）（适中）（通气过量、转速过快）NH4+：酮戊二酸谷氨酸谷酰胺（缺乏）（适量）（过量）pH：谷酰胺，N乙酰谷酰胺谷氨酸（pH58，NH4+过多）（中性或微碱性）磷酸：缬 氨 酸谷氨酸（高浓度磷酸盐）生物素：乳酸或琥珀酸谷氨酸（过量）（限量）,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,2、控制细胞渗透性 代谢产物的细胞透性是氨基酸发酵的重要因素，只有使细胞内的氨基酸渗透到细胞外，才能大量积累氨基酸。（1）生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。（2）青霉素：抑制细

14、胞壁的合成，由于细胞内外的渗透压的差异使谷氨酸泄漏出来。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,3、控制旁路代谢 例如：L异亮氨酸的生物合成可由L苏氨酸改为D苏氨酸途径，即采用旁路代谢。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,4、降低反馈作用物的浓度 控制反馈作用物浓度，克服反馈抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反应能够顺利进行。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,5、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用，是通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法来进行。例：利用抗性突变株消除S（氨基乙酸）L

15、半胱氨酸（即AEC）（赖氨酸的结构类似物）与L苏氨酸的协同抑制。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,6、促进ATP的积累，增加氨基酸的生物合成 氨基酸的生物合成需要能量，ATP的积累可促进氨基酸的生物合成。,25.2 氨基酸发酵的代谢控制,25.2 氨基酸发酵的代谢控制与育种,25.2.3氨基酸产生菌的定向育种代谢控制发酵：根据菌种的代谢特性，人为改变菌种的代谢调控机制，使微生物体内的的代谢流按照人们所要求的方向进行，过量积累氨基酸。代谢控制发酵的前提是选育出特定的菌种。氨基酸菌种选育的成果是代谢调控理论应用于育种实践的成功典范。,选择出发菌株：前人经验；代谢途径

16、简单、清楚；易于解除代谢控制机制。育种原理：部分或全部解除微生物对氨基酸合成代谢的自我调节机制育种方法：传统方法 现代方法 定向育种,25.2.3.1解除反馈调节-结构类似物抗性株选育 所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?,25.2.3.2切断支路代谢营养缺陷型的选育野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶

17、合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。营养缺陷型切断一些相关的代谢流，消除了协同控制机制，可以过量积累特定氨基酸。利用营养缺陷型菌株生产时，营养缺陷物质的添加量一般在亚适量水平，否则引起反馈抑制。目前，营养缺陷型和抗结构类似物育种常联合,25.2.3.3优先合成的转换渗漏缺陷型的选育通过诱变，使分支代谢途径中优先合成途径中高活性的酶活性降低，代谢流转换进入非优先合成的途径，使其终产物氨基酸过量积累。如下图，赖氨酸合成中，如果降低高丝氨酸脱氢酶活性，则优先合成赖氨酸。,O-琥珀酸高丝氨酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酸-半醛,高丝氨酸,二氢吡啶-2

18、，6-二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸磷酸,苏氨酸,蛋氨酸,异亮氨酸,优先合成,反馈抑制,阻遏,25.2.3.4选育温度敏感突变株通过诱变，选育出在低温条件下能正常生长，而在高温条件下不能生长的菌株，称为温度敏感突变株。这是因为突变株基因发生转换或颠转，编译的酶对温度敏感，在高温时成为营养缺陷型。,25.2.3.5改变细胞膜的通透性把合成的氨基酸尽快排出细胞外，预防反馈抑制，大量合成氨基酸。如、生物素缺陷型、油酸缺陷型和甘油缺陷型。,25.3氨基酸生产工艺,氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：谷氨酸族

19、（-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；天冬氨酸族（草酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。,25.3.1氨基酸的生物合成,氨基酸的生物合成,25.3.1.1 谷氨酸的生物合成途径与代谢调节,生产谷氨酸的主要菌株生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径,Glu发酵常用菌种 谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)北京棒杆菌(C.peiking AS.1229)黄

20、色短杆菌(Brevibacterium flavum)乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum),1、谷氨酸发酵的代谢途径,生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸,CO2固定酶系活力强,C

21、itrate synthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强,乙醛酸循环弱,异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱,谷氨酸脱氢酶能力强,控制谷氨酸合成的重要措施,乙醛酸循环的作用,谷氨酸发酵的代谢途径,乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环,2 谷氨酸生物合成的调节机制,优先合成与反馈调节生物素的调节作用,优先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸柠檬酸合成酶的调节 柠檬

22、酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制,（1）优先合成与反馈调节,-酮戊二酸脱氢酶的调节在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱谷氨酸脱氢酶的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸,Glc,丙酮酸,草酰乙酸,CO2,天门冬氨酸（Asp）,AC-coA,CO2,羧化酶,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,Glu,反馈抑制,谷氨酸,脱氢酶,-酮戊二酸,脱氢酶,合成酶,反馈阻遏,Glu产生菌主要生理生化特性 需氧，生物素缺陷型bio-,有乙醛酸循环，

23、羧化酶活性强（bio作为辅酶）柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，Glu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于Glu胞外分泌。,（2）生物素对代谢的调控作用,生物素对CO2固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以上），CO2固定反应可提高30%。,生物素对糖代谢速率的影响 生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出 生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥

24、珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动。,生物素控制磷脂的合成使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中,控制生物素添加量使菌种生产Glu 高浓度bio增强羧化酶活性，促进羧化反应

25、利于Glu合成。低浓度bio降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向Glu合成，低浓度bio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于Glu胞外分泌，解除反馈调节，利于Glu合成并大量积累。添加亚适量，5-10g/L 培养基，生产Glu,培养前期，bio充足，存在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累Glu，细胞形态正常。,8hr,Glu非积累型细胞,Glu积累型细胞,培养中后期，bio浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未溶解。,25.3.1.2 Lys代谢控制发酵

26、,生产菌种 谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）黄色短杆菌(B.flavum)乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径及正常调控机制,氨基酸的生物合成,Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、Ile，最后合成LysThr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏,3.Lys 代谢控制发酵 菌种的遗传改造(1)切断支路代谢Hse营养缺陷型(Hse-)菌株筛选 选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌

27、体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys(2)用Hse-菌株选育解除Lys反馈抑制突变株,Hse-,诱变,Hse-Lys反馈抑制,Hse-抗Lys反馈抑制,长出菌落(Hse-,AECr),基本培养基Hse(高浓度)AEC(Lys结构类似物，S-（2-氨基乙基）L-半胱氨酸),Hse-,AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同反馈抑制，大量积累Lys,(3)Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株日本椎尾等人 黄色短杆菌 突变株,亚硝基胍,Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/

28、30Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长代谢流转向Lys大量合成Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，大量积累Lys，产量达25g/L,(4)Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量谷氨酸棒杆菌 Hse K.Nakyama 13g/LHseAECR 中山清（日本）42g/L黄色短杆菌 HseAECRCSIFps I.shiio 51g/L(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维 50-55g/L钝齿棒杆菌 pI-3-2 Hse-AECr 陈琦 50g/L,(5)乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒

29、杆菌、黄色短杆菌。特殊调控：代谢互锁调控机制 互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径产物反馈调节Lys生产菌种遗传标记和产量：HseAECRLeu 110g/L（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）HseAECRLeu-TARAla 110g/L（加Hse、Leu，限量加Ala，-TA是Leu结构类似物噻唑丙氨酸）,Asp,Asp激酶,Asp-P,Asp-半醛,Hse,Met,Thr,Lys,Ile,DDP,协同反馈抑制,DDP还原酶,DDP合成酶,反馈抑制,Ala,Leu,反馈阻遏,赖氨酸生物合成途径,大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径：图23-2,三、异亮氨酸、亮

30、氨酸生产工艺,1、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径：图23-4,2、异亮氨酸发酵,两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法添加前体发酵法：苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制；添加前体物质D-苏氨酸、-酮基异戊酸；绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。直接发酵法：抗反馈调节突变株，解除对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。,3、亮氨酸发酵,亮氨酸高产菌株的选育：1）选育-酮基异丁酸抗性突变株，解除对异亮氨 酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用；2）选育异亮氨酸缺陷型回复突变株，其-异丙基苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反馈抑制；3）-噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突变株，用于亮氨酸的发酵生产。,25.3

31、.2 氨基酸发酵的工艺控制,培养基pH温度氧,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度要适当，避免碳源浓度过高，否则对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 2、氮源：铵盐、尿素、氨水；同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时分解或形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌，40的尿素可在10840min，高温会生产缩脲。氨水用pH自动控制连续流加,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 3、碳氮比

32、氮源除用于菌体生长外，还用于氨基酸合成，在氨基酸发酵中常常是用氨水、尿素来调节pH，所以氨基酸发酵所用的C/N比一般微生物发酵的低，或者说氮源用量更高。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 3、碳氮比 谷氨酸发酵在C/N小于100:11才开始积累谷氨酸，所以发酵的C/N为100:(1530)。合成菌体使用36的氮源；合成谷氨酸用去3080氮源。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基4、NH4+浓度：过低增加-酮戊二酸积累，过高使谷氨酸转化为谷酰胺。5、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。6、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。7、

33、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基8、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。9、锰：是许多酶的激活剂。10、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。11、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。,25.3 氨

34、基酸发酵的工艺控制,pH对氨基酸发酵的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,pH对氨基酸发酵的影响及其控制主要是影响酶的活性和菌的代谢，主要采用流加尿素的方法控制。控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,温度对氨基酸发酵的影响

35、及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。谷氨酸前者3032C，后者3437C。菌体生长阶段温度不宜过高，否则菌体易衰老，pH增高，糖耗减慢，酸产量低。当菌体生长温度过高时：要减少通风量，少量多次流加尿素，来促进菌体生长。发酵中后期：维持合成温度，以利氨基酸合成。,25.3 氨基酸发酵的工艺控制,氧对氨基酸发酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸生

36、产概述起初工业化生产采取小麦或大豆蛋白质水解制取。1957年，日本率先采用微生物发酵生产，并实现工业化，被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节调控水平。目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。我国现有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸产生菌株特点革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸生物合成机理 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。,25.4 谷氨酸生产工艺,淀粉的酸水解工艺1、调浆：干淀粉用

37、水调成10-11Bx（波美）的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。2、糖化：蒸汽加热、加压293.4-344.3KPa，糖化25min。3、中和：冷却至80，烧碱中和至pH4.0-5.0（避免产生焦糖又保证过滤，中和为沉淀胶体）。4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70及酸性条件下搅拌后过滤。,25.4 谷氨酸生产工艺,淀粉的酶法糖化工艺 以大米或碎米为原料时采用大米浸泡磨浆，再调成15Bx，pH6.0，加细菌-淀粉酶在85 下液化30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。,25.4 谷氨酸生产工艺,糖蜜原料 不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，

38、因含丰富的生物素。预处理方法：活性炭或树脂吸附和亚硝酸法破坏以减少糖蜜中的生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。,25.4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。,25.4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH 6.56.8。1

39、000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。,25.4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使该期缩短。2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降；溶氧急剧下降后维持在一定水平；菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八

40、字形；不产酸；12h。措施：采取流加尿素办法及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH在7.5-8.0；维持温度30-32,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成，糖和尿素分解产生-酮戊二酸和氨用于合成谷氨酸。措施：及时流加尿素以提供足够的氨并使pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37。4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h。,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到

41、正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。接种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（3）pH 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨

42、酰胺，过低氨离子不足,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。,25.4 谷氨酸生产工艺,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸的提取 1、等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。收率可达8090。,25.4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸制造味精的工艺流程 味精谷氨酸单钠，具

43、有强鲜味，由谷氨酸用适量的碱中和得到，目前已经是人们日常生活中的常用烹调用品，国内消耗量很大。,谷氨酸发酵研究新进展继续选育突变菌株：转化率高、高生物素含量下保持高产酸、提高原料利用率、拓宽原料来源、简化操作。生物工程新技术应用：DNA重组技术、原生质体融合技术、固定化细胞技术，产量提高了1倍。改进发酵工艺：开拓原料、改进流加工艺、计算机控制。,25.4 谷氨酸生产工艺,概述赖氨酸：L-2,6-二氨基己酸，为人体必需的八种氨基酸之一。菌种：谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株，抗赖氨酸结构类似物、抗苏氨酸结构类似物。生产方法：原用提取法、化学合成法、酶法，自1960年日本直接发酵成功后现在已经是

44、主要方法。,25.5 赖氨酸生产工艺简介,赖氨酸的发酵控制氨基酸控制：苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸产生菌的生长因子。该菌缺乏蛋白质分解酶，有机氮源需经水解后才能使用。生物素：赖氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，限量的生物素有利于谷氨酸积累，大量的生物素抑制谷氨酸生成，增加天冬氨酸，提高赖氨酸产量。,25.5 赖氨酸生产工艺简介,赖氨酸的发酵控制赖氨酸发酵的工艺条件：温度：前期32，中后期34。pH：6.57.5，最适6.57.0。pH控制：流加尿素或氨水。种龄和接种量：对数生长期种子；二级种子接种量2，种龄一般为812h；三级种子种量10，种龄68h。供氧：充足。,25.5 赖氨酸生产工艺简介,赖氨酸的提取与精制发酵液预处理：离心分离或沉淀去除菌体。离子交换法提取赖氨酸：赖氨酸等电点9.59，pH=2.0左右用强酸性阳离子树脂交换，pH7.09.0间用弱酸性阳离子树脂交换。采用铵型树脂，对碱性氨基酸能选择性交换，用氨水洗脱，不必再生和转型。精制：离交柱洗脱液中含游离氨基酸和氢氧化铵，真空蒸发去氨，用盐酸成盐，结晶，分离，干燥。,25.5 赖氨酸生产工艺简介,