分子生物学第五章 分子生物学研究法课件.ppt
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1、第五章 分子生物学研究方法,1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、RNA基本操作技术4、核苷酸序列分析,分子生物学从20世纪中叶开始高速发展,最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。,基因操作:DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。,基因工程:在体外将核酸分子插入载体分子中,使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。,本章将在回顾重组DNA技
2、术史上主要事件基础上,讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。,51 重组DNA技术史上的重大事件,半个世纪以来,分子生物学研究主要取得了3大成就:第一 解决了遗传的物质基础问题 基因的分子载体是DNA;,51 重组DNA技术史上的重大事件,第二 DNA分子的双螺旋结构模型和半保 留复制机制,解决了基因的自我 复制和世代交替问题;,51 重组DNA技术史上的重大事件,第三“中心法则”和操纵子学说,成 功地破译了遗传密码,阐明了 遗传信息的流动与表达机制。,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。,重组DNA的
3、核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。,限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972,Boyer实验室发现核酸内切酶EcoR I能特异识别GAAUC序列,将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。,EcoR l酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。,目前为止,科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段,再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开,以供下一步研究。,52 DNA基本操作技术 521 核酸凝胶电泳技术,
4、1.基本原理 生物大分子在一定pH条件下,通常会带电荷。将其放置到电场中,就会以一定的速度移向适当的电极。,521 核酸的凝胶电泳,1.基本原理 分子在电场作用下的迁移速度与电场强度和电泳分子所带的净电荷数成正比,与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。,521 核酸的凝胶电泳,1.基本原理 根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数,可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子(磷酸基团),在电场中会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度,取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术
5、分离DNA片段的基本原理。,2.琼脂糖凝胶电泳,化学修饰的低熔点琼脂糖(线性多糖聚合物),在较低温度下便会熔化,冷却凝固便形成良好的电泳介质。常用于DNA片段的电泳制备。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间;而聚丙烯酰胺凝胶(SDS)分辨范围为1-1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。,如20%的SDS凝胶可分离1-6bp的DNA小片段,而分离1000bp的DNA片段则用3%的SDS凝胶。再如2%琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子,而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%-1.0%)的琼脂糖凝胶。脉冲电场凝胶电泳
6、(PFGE)可分离50Kb的DNA小片段,溴化乙锭(EB)能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4),并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光,荧光强度与DNA片段的数量成正比(可检测到0.05g的DNA)。把EB直接加到凝胶介质中或电泳后染色。,细菌转化:细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料,也是基因工程重要的实验菌株。,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克隆细菌转化方法 CaCl2法、电击法(电脉冲)、体外包装法(噬菌体),大肠
7、杆菌低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中,外源DNA粘附在细胞表面,立即将其转到42下做短暂的热刺激,外源DNA被细胞所吸收(感受态)。,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,523 基因扩增,聚合酶链式反应即PCR技术,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应,经数小时之后,就能将极微量的目的基因或某一特定DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。,PCR技术的原理,先将双链DNA分子加热分离成单链,单链DNA模板种dNTP DNA聚合酶新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点,由加入到反应体系中的一对引物决定的。,PCR反应的全过程,反应包括DNA解链(变性)、
8、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步,被不断重复。多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA数,即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值是2n。,待扩增DNA样品94 1min 变性(解链)56 1min 退火(引物结合靶DNA区段)72 1至数分钟延伸,合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后,温度由PCR仪调整,程序完成后可以拿到产物。,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,【开发史】这项技术的发明人是
9、Kary Mullis。1983年,在一家生物高技术公司(Cetus)工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题,有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上,灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法,即PCR。,在1985年的一次学术会议上,此方法首次被介绍,在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法,很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。,Cetus给了Mullis一万美元的奖金,随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内,PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段,并得到了广泛的实际应用,被许多科
10、学家视为近十年分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年,Mullis因此获得诺贝尔化学奖。,(1)PCR技术简史,PCR的最早设想,核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的变性与复性,DNA的变性与复性,DNA的变性与复性,PCR的实现,1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反
11、应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是:Klenow酶不耐高温,90失活,每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行易发生碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。,PCR的改进与完善,1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新
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