临床生物化学检验技术 11 第11章 体液中酶的生物化学检验课件.ppt
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1、临床生物化学检验技术,第十一章 体液中酶的生物化学检验,贵阳医学院 潘卫,本章思考题,简述血清酶的分类简述血清酶含量变化的机制简述影响血清酶变化的因素简述ALT、AST、CK、LDH、GGT、AMY、ChE的项目检测依据,思考题,本章思考题,简述ALT、AST、CK、LDH、GGT、AMY、ChE的临床意义、检测原理以及方法学评价简述同工酶及其亚型检测的临床意义,思考题,目录,第一节 概述第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶(ALT、AST、-GT、CK、LDH、ALP、ACP、AMY、LPS、ChE、5-NT、LPL、MPO)第三节 酶学检测在临床上的应用,目录,第一节 概述,重点提示,1.明
2、确血清酶的分类2.了解血清酶的变化机制3.掌握影响血清酶的变化因素,重点,在已知的3000多种酶中证明人体内存在的至少2000多种。当细胞缺氧、炎症、损伤或实质细胞数量变化时,血浆中酶的含量会发生明显变化,这种变化可以提示病变的部位和严重程度。因此,全面了解酶的分类、变化机制以及影响因素有助于对酶含量变化做出合理解释,第一节 概述,概述,一、血清酶的分类,除凝血酶和纤溶酶外,血清酶与血浆酶基本一致。根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况,可将血浆酶分成血浆特异酶和非血浆特异酶两大类。前者主要指在血浆中发挥特定的催化作用的酶,也称血浆固有酶。它们以酶原形式分泌入血,在一定条件下被激活,引起相
3、应的生理或病理变化,血清酶的分类,一、血清酶的分类,血浆特异性酶大多数在肝脏合成,当肝功能减退时,可见血浆中这些酶活性降低。属于这一类性质的酶还有胆碱酯酶、铜氧化酶(铜蓝蛋白)和脂蛋白脂酶等,血清酶的分类,一、血清酶的分类,非血浆特异酶在血浆中浓度很低,并且在血浆中很少发挥催化作用。可进一步细分为外分泌酶 细胞酶,血清酶的分类,一、血清酶的分类,外分泌酶来源于消化腺或其他外分泌腺,如胰淀粉酶、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关,血清酶的分类,一、血清酶的分类,细胞酶存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随细胞的新陈代谢,有少量酶释入血液
4、。其中大部分无器官专一性,只有小部分来源于特定的组织,有器官专一性。这类酶细胞内外浓度差异悬殊,病理情况下血浆中极易升高,其下降的临床意义很少。这些酶最常用于临床诊断,如丙氨酸氨基转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等,血清酶的分类,二、血清酶的变化机制,正常情况下,组织细胞内发挥催化作用的酶在血清中含量甚微,组织器官受损造成细胞破坏或细胞膜通透性增高时,细胞内的某些酶大量释放入血;细胞的转换率增高或细胞的增殖加快,其特异的标志酶可释放入血;细胞内酶的合成或诱导增强或酶的清除受阻也可引起血清酶活性升高,血清酶的变化机制,二、血清酶的变化机制,血清中酶的清除方式与其他血浆蛋白质类似血清酶的半寿期是指酶失
5、活至原来活性一半时所需时间(T1/2),可以表示酶从血中清除的快慢。不同血清酶甚至血清酶的同工酶之间半寿期差别很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异,血清酶的变化机制,二、血清酶的变化机制,常见的几种血清酶的半寿期与分子量,三、影响血清酶的因素,(一)生理变异 包括性别、年龄、饮食、运动、妊娠等多个方面(二)病理变化 许多疾病会导致血清酶水平的改变,其对疾病的诊断和监测有重要价值。详见本书相关章节,影响血清酶的因素,(一)生理变异,性别 多数血清酶的男女性别差异不大,但少数酶如肌酸激酶(creatine kinase,CK)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,
6、ALP)及-谷氨酰基转移酶(-glutamyl transpeptidase,-GT)等有性别差异,男性高于女性,生理变异,(一)生理变异,年龄 如新生儿血清中ALP略高于成人,15岁增至成人的23倍,然后逐渐下降,到1015岁,ALP又明显升高,可达成人的35倍,20岁后降至成人值。此外,CK、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)也随年龄而变化,生理变异,(一)生理变异,饮食 血清中大多数酶不受进食的影响,故测酶活性不一定需要空腹采血。但高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。而酗酒可使血清-GT升高,如未累及肝
7、脏,戒酒后酶活性下降。此外,禁食数天可导致血清-淀粉酶(-amylase,AMY)下降,生理变异,(一)生理变异,运动 激烈的肌肉运动可使血清中多种酶,如天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、醛缩酶(aldolase,ALD)和CK、LDH等活性升高,升高幅度与运动量、运动时间、运动频率及骨骼肌所含酶量有关,生理变异,(一)生理变异,妊娠 妊娠时随着胎盘的形成和长大,胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液,如耐热ALP、LDH和ALT(少数)等,引起血清中这些酶升高,生理变异,
8、(二)病理变化,酶合成异常 包括合成减少和合成增多,是影响血清酶变化的重要因素,这些酶大多数是在肝脏中合成,当肝功能障碍时酶浓度常下降。此外酶基因变异也可引起特定酶减少或消失,病理变化,(二)病理变化,酶释放增加 酶从病变(或损伤)细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制,影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面细胞内、外酶浓度的差异:非血浆特异性酶在细胞内、外浓度可差千倍以上,只要少量细胞受损,酶从细胞中释放,就可使血清酶明显升高,病理变化,(二)病理变化,酶释放增加 酶从病变(或损伤)细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制,影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面酶在细胞
9、内的定位和存在的形式:胞质中游离的酶如ALT、LDH最容易释放入血,而在亚细胞结构中的酶则较难释放出来,特别是线粒体酶,病理变化,(二)病理变化,酶释放增加 酶从病变(或损伤)细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制,影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面酶蛋白分子量的大小:试验证明酶释放的速度大约和分子量的大小成反比,次因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响,例如LDH分子量大于CK,而当心肌梗死时,LDH在血液中升高的时间就晚于CK,病理变化,(二)病理变化,酶清除异常 不同的疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同,同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样,这和酶的半
10、寿期以及一些其他因素有关,病理变化,第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶,重点提示,掌握各个酶的检测方法、检测原理、方法学评价熟悉各个酶检测的注意事项、参考区间以及临床意义,重点,血浆中的代谢酶与某些特定组织器官疾病的相关性引起了人们的重视,并进行了深入的研究,使诊断酶学得到了快速的发展。本节将重点介绍临床上常用酶与同工酶的测定方法及临床意义,第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶,临床诊断中常用的酶与同工酶,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,(一)检验项目项目检测依据 丙氨酸氨基转移酶(ALT),也称谷丙转氨酶(GPT),是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶,加快体内蛋白质氨基酸在体内转化ALT广泛存在于肝
11、脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺,白细胞和红细胞中,以肝脏中的含量最多。这些组织发生损伤或坏死时,酶从这些组织细胞中释放,致使血清中的ALT活性升高,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,临床意义肝细胞中ALT含量较多,且主要存在于肝细胞的可溶性部分。在肝脏受损时,ALT会释放入血,导致血中ALT活性浓度增加,因此测定ALT常作为判断肝细胞受损的灵敏指标,但其他的疾病或因素也可能引起ALT不同程度的增高。临床上常同时测定ALT和AST含量来诊断和鉴别诊断肝脏疾病及其病变程度,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,常见疾病ALT和AST及同工酶的变化,一、丙氨酸氨基转
12、移酶的测定,1.血清ALT活性增高(1)肝胆疾病 传染性肝炎、肝癌、中毒性肝炎、脂肪肝和胆管炎等(2)心血管疾病 心肌梗死、心肌炎、心力衰竭时肝淤血和脑出血等,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,1.血清ALT活性增高(3)药物和毒物 氯丙嗪、异烟肼、水杨酸制剂及乙醇、铅、汞或有机磷等引起ALT活性增高2.血清ALT活性降低 磷酸吡哆醛缺乏症,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,应用评价转氨酶能够反映肝细胞损害程度,是用于肝脏疾病时观察疗效、判断预后的重要指标之一。但ALT缺乏特异性,存在于多种组织,并且有多种原因能造成肝细胞膜通透性的改变,如:疲劳、饮酒、感冒
13、甚至情绪因素等。另外,ALT活性变化与肝脏病理组织改变并不完全一致,在严重肝损伤患者ALT并不升高。因此肝功能损害需要综合其他情况来判断,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,(二)检测方法检测原理连续检测法ALT可催化L-丙氨酸和-酮戊二酸生成L-丙氨酸。丙氨酸、NADH和H+在LDH作用下可转化出NAD+,连续监测在340nm处NADH的吸光度下降速度来计算酶活性,该法属于酶偶联法,反应式如下,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,方法学评价IFCC推荐方法将原法测定温度从30改为37,将-酮戊二酸的用量从改良赖氏法的2mmol/L改为15mmol/L,以足了最
14、大反应速度对-酮戊二酸的用量要求,扩大了测定范围,提高了测定准确性。并对试剂组成做了详细的规定LDH应用兔肌来源的干粉制剂,不能选用硫酸铵悬浮液可加入叠氮钠和白蛋白来保持其活性酶制剂和清蛋白中应没有ALT和GLDH的污染,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,该法的缺陷是存在GLDH和内源性丙酮酸的干扰,但采用双试剂及底物启动的模式,和(或)延长延滞期可消除部分干扰。为了进一步减少干扰,测定过程中还要用无氨蒸馏水和不含杂酶的高纯度的试剂,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,另外,IFCC推荐法建议试剂中添加5-磷酸砒哆醛,其目的是使脱辅基的酶恢复酶活性,提高结果的
15、准确性,特别是部分肿瘤化疗病人和肾病病人会出现脱辅基的酶,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,参考区间2013年,我国卫生部发布了关于ALT的行业标准,反应温度37,试剂中不含5-磷酸吡哆醛时,成年人参考区间为男性950U/L,女性740U/L,丙氨酸氨基转移酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,(一)检验项目项目检测依据天冬氨酸氨基转移酶(AST),也称谷草转氨酶(GOT),AST和ALT是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶。AST催化天门冬氨酸和a-酮戊二酸的氨基转移作用,形成谷氨酸和草酰乙酸,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,
16、AST广泛分布于全身各组织,尤其以骨骼肌、心脏、肝脏和肾脏中最为丰富,在细胞内定位于线粒体(m-AST)和胞质(c-AST)中,同ALT,但约70%为m-AST。当这些组织细胞损伤或坏死时,由于细胞膜通透性增加,胞浆内的AST释放入血,致使血清中的AST活性升高,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,临床意义 AST在心肌细胞内含量较多,当心肌梗死时,血清中AST活力增高,在发病后612h之内显著增高,在48h达到高峰,约在35天恢复正常。血清中AST也可来源于肝细胞,各种肝病可引起血清AST的升高,有时可达1200U/L,中毒性肝炎还可更高 肌炎、胸膜炎、肾
17、炎及肺炎等也可引起血清AST的轻度增高,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,应用评价在临床上血清AST主要用于诊断急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI),也是肝炎患者的观察指标,AST/ALT比值对于判断肝炎的转归特别有价值,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,(二)检测方法检测原理连续检测法AST可催化L-天冬氨酸和-酮戊二酸生成草酰乙酸,草酰乙酸、NADH和H+在苹果酸脱氢酶(malic dehydrogenase,MD)作用下产生NAD+,连续监测在340 nm处NADH的吸光
18、度下降速度来计算酶活性。该方法属于酶偶联法,其反应式如下,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,方法学评价与ALT基本相同,IFCC推荐法用MD作指示酶。由于产物草酰乙酸不稳定,易转变为丙酮酸,故在试剂中加入LDH,实质是两个指示酶,但通常将LDH作为辅助酶,该法预孵育期较长,达90 s,目的是在预孵育期间将内源性的丙酮酸转化为乳酸,从而减少内源性丙酮酸的干扰,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,参考区间酶活性测定温度37,底物中不加5-磷酸吡哆醛时成年人参考区间为840U/L,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰
19、转肽酶及同工酶的测定,(一)检验项目项目检测依据-谷氨酰基转移酶(GGT)又称-谷氨酰转肽酶(-GTP或GGTP)是一种含巯基的线粒体酶,参与体内谷胱甘肽的代谢,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰基转移酶及其同工酶的测定,肾脏、肝脏和胰腺中GGT含量丰富,但血清中GGT主要来自肝胆系统。GGT在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统,因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时,血清中GGT增高,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化肾脏疾病 人体器官中GGT含量以肾脏最高,其次是前列腺、胰腺、肝脏、盲肠和大脑。在肾脏、胰腺和肝脏中,GGT
20、的含量比为100:8:4。肾脏中的GGT含量虽高,但在肾脏疾病时,血液中的GGT活性升高却不明显。测定尿中GGT活性有助于诊断肾小管疾病,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化肝脏疾病 血清GGT主要用于诊断肝胆疾病。原发性肝癌、胰腺癌和乏特壶腹癌时,血清GGT活性显著升高,特别是在诊断恶性肿瘤患者有无肝转移和肝癌术后有无复发时,阳性率可达90%。GGT同工酶与AFP联合检测可使原发性肝癌AFP检测的阳性率明显提高,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化其他 嗜酒或长期服用某些药物如苯巴比妥、苯妥英钠、安替
21、比林时,血清中GGT活性也会升高。口服避孕药会使GGT值增高20%,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,常见疾病GGT活性的变化,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,应用评价血清GGT主要用于诊断肝胆疾病,GGT同工酶与AFP联合检测可使原发性肝癌AFP检测的阳性率明显提高GGT是一种底物特异性不高的酶,能作用于一系列含谷氨酰基的化合物,其生理功能尚不十分清楚,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,(二)检测方法检测原理以色素原GCNA为底物,甘氨酰甘氨酸为受体,GGT催化-谷氨酰基团从GCNA转移到甘氨酰甘氨酸上,并游离出2-硝基-5-氨基
22、苯甲酸。2-硝基-5-氨基苯甲酸的生成量与样品中的GGT活性成正比关系,因此,测定405 nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。其反应式如下,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,方法学评价GCNA第3位上含有亲水基团羰基,溶解度增加,且底物稳定性较好,自身水解作用小。需要注意的是原IFCC推荐方法的测定pH为8.20,反应温度30,若反应温度37时最适pH则为7.70,并要以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系,甘氨酰甘氨酸既是缓冲液又可看成是底物,与甘氨酸或甘氨三肽为受体相比,酶促反应速度可以提高5倍,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,
23、方法学评价GCNA第3位上含有亲水基团羰基,溶解度增加,且底物稳定性较好,自身水解作用小。需要注意的是2-硝基-5-氨基苯甲酸在410 nm处的摩尔消光系数()为7.96103(pH为7.70),受pH和温度影响较大。若选择401 nm或405 nm时需注意校正由于产物摩尔消光系数较小,样品用量大,样品体积分数0.0909,为了样品和反应液在37平衡,故需要孵育时间180s,并采用底物启动模式,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,参考区间成年男性GGT 1150U/L(37)成年女性GGT 732U/L(37),-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的
24、测定,(一)检验项目项目检测依据肌酸激酶(CK)能催化高能磷酸键在肌酸和ATP之间转换,生成磷酸肌酸和ADP的可逆反应。磷酸肌酸的高能磷酸键是肌肉收缩时能量的直接来源,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,(一)检验项目项目检测依据CK主要分布在脑组织和各种肌肉组织中,CK为二聚体结构,由M和B两个亚基构成,可组成三种同工酶,即CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK-MM主要存在于骨骼肌中,平滑肌以CK-BB含量相对较高,CK-BB在脑中的含量明显高于其他组织,心肌是CK-MB含量丰富的唯一器官。当这些组织器官受损伤时,血清中CK的含量升高,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌
25、酸激酶及其同工酶的测定,临床意义血清CK主要用于心肌梗死的诊断。心肌梗死发生后48h,CK开始升高,1248h达最高峰,可达正常上限的1012倍,在24d降至正常水平。CK对诊断心肌梗死较AST、LDH的阳性率高,特异性强,是用于心肌梗死早期诊断的一项较好的指标,同时对估计病情和判断预后也有一定的参考价值。但在测定时可受样品溶血情况的影响。CK-MB是目前公认的诊断AMI较有价值的生化指标病毒性心肌炎时,CK也会升高,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,临床意义皮肌炎、肌营养不良、骨骼肌损伤等也会使CK升高脑膜炎、脑血管意外、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、
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