第五章PCR实验中的样本制备课件.ppt

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1、PCR实验中的核酸制备技术,海南省农垦总医院 朱中元教授、主任技师、Ph D,在临床基本扩增检验中，由于临床标本中常含有蛋白和脂类等干扰核酸扩增的物质，因而核酸提取是进行核酸扩增前不可或缺的一个步骤。核酸分离纯化技术起源于20世纪50年代，在70年代和80年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广，,但由于传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤，不但繁琐，而且增加了环境因素对标本以及标本间相互污染的机会，不但在RNA检测时，易出现假阴性，而且当使用极为敏感的聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）及体外转录

2、扩增系统检测时，易得到假阳性结果。,同时，由于这些方法要用到一些挥发性的有机溶剂，故对实验操作人员的身体健康有一定的影响。因此，简单而又高效且无需使用酚和氯仿的核酸提取方法对上述敏感的基因扩增检测技术的广泛应用有重要意义。,此外，标本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此，在核酸测定时，样本的处理及保存，对保证测定的准确有效尤为重要。临床基因扩增检验中常涉及的标本有血清（浆）、全血、外周血单个核细胞、分泌物、拭子、脓、体液、石蜡切片、新鲜组织等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。,第一节 临床标本的处理和保存,血清（浆）标本,在某些病原体如乙型肝炎病毒（hepatit

3、is B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）和人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）等的PCR临床测定中，标本的获取和保存，对于DNA测定，可能按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大，,但对于RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。有研究表明，用于RNA测定最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除）全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快（2小时内）分离血清，标本的短期（1-2周）保存可在-20下，较长期保存应

4、在-70。,以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-Na2 或枸橼酸钠，不可使用肝素。全血样本如用于DNA提取检测，可4下短期保存，如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA,全血标本,外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤，即可得到单个核细胞。外周血单个核细胞如暂不得取核酸，可保存于-70下。,外周血单个核细胞,痰属于分泌物，临床上常用作为结核分枝杆菌DNA测定标本。由于痰标本中含有大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，需对标本进行初步处理，即用1 mol/L NaO

5、H液化。,痰,需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长，液化标本如不立即用于核酸提取，可保存于-70下。此外，如用于非结核分枝杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。,在使用PCR方法检测性病病原体时，临床标本一般为棉拭子，可将棉拭子置于适量生理盐水中，充分震荡洗涤后，室温静置5-10分钟，待大块状物下沉后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于DNA提取，如不立即用于核酸提取，则需保存于-70下。,棉拭子,脓液的处理依情况而定，如用于分枝杆菌（如结核分枝杆菌）核酸测定的标本，粘稠的脓液可采用痰

6、标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后，即可用于DNA提取。,脓液,对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如过于粘稠，则加入适量生理盐水，充分振荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA提取；如为水样，则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70。,临床体液标本包括胸水，腹水，脑脊液，尿液等，可按水样标本的方式离心取沉淀后，提取核酸。沉淀样本的保存同上。,体液,组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步骤首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。,组

7、织,新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4可保存6年。,石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。总而言之，标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决定性作用。在这里要着重强调的一点是，所有用于上述临床标本收集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌。,其它标本,尿液前列腺液尿道口分泌物阴道分泌物宫颈口粘液咽喉拭子、鼻腔分泌物粪便,第二节 核酸的提取方法一、DNA提取

8、的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的“酚-氯仿提取法”。这种方法提取的DNA纯度高，效果好，缺点是较为繁琐。方法如下：,1试剂（1）蛋白酶K缓冲液：50mmol/L KCl,10-20mmol/L Tris-HCl,2.5mmol/L MgCl2,pH8.3,1%laureth 12(一种表面活性剂)0.5%Tween 20,100 ug/ml蛋白酶K。,（2）饱和酚：市售酚经重蒸馏后（如贮存，则于-20下，用前从冰箱取出，与室温平衡后，68下使酚溶解），加入等体积的0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)磁力搅拌15分种移出上层水相；重复上述抽提过程，直至酚相的pH大于7.8，

9、酚达到平衡最后一次取出液相后，,加入0.1体积含有0.2%-巯基乙醇的0.1mol/L Tris HCl(pH8.0)，这种形式的酚溶液可装在不透光的瓶中并处于10mmol/L Tris-HCl（Ph8.0）缓冲液层之下，可4下保存一个月。,TE缓冲液,10mmol/L Tris-Cl,1mmol/L EDTA,pH7.5或8.0。,2提取步骤 1、临床标本经前处理后 加入蛋白酶K缓冲液 56温育1小时 加入等体积饱和酚，充分振荡混匀,12000rpm离心5分种 取水相，加入等体积氯仿 混匀，12000rpm离心2分钟取水相，加1/10体积的3mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇,-203

10、0分钟或过夜12000rpm离心10分种弃上清，用预冷75%乙醇洗3次干燥取20l TE或无菌去离子水悬浮4备用,二、RNA的提取 RNA的提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase较耐高温，不易失活。因此在提取RNA时，如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解，是保证RNA成功提取的关键所在。,（一）RNA提取所用器皿的处理及溶液的准备 经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管，离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA，实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染，使用前必须于180

11、干烤8小时以上，或用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其它用品。,DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上良量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。,要注意的是，DEPC有致癌性，操作时须小心。对于RNA提取所需溶液的配制，必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNase的玻璃器皿。,可能的话，溶液均应用0.1%DEPC于37至少处理12小时,然后于100加

12、热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟.须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液.,（二）RNA提取中RNase污染的控制 实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。因此，在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时，以及在涉及RNA的整个提取操作过程中，都应戴一次性手套。,实验中，如触摸“脏的”玻璃器皿和其它物品以后手套就可能会沾染上RNase，因此在RNA提取实验中，应勤换手套。常用的RNase抑制剂有以下几种：,1RNase的蛋白质抑制剂 这种RNase的蛋白质抑制剂是从人胎盘分离得

13、到，可与多种RNase以非共价方式紧密结合，从而使RNase失活。其可置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50%甘油中，贮存于-20。,2钒核糖核苷复合物 这种复合物由氧钒（IV）离子和4种核糖核苷之中的任一种所组成，能与多种RNase结合，并几乎能百分之百地抑制RNase的活性。,3硅藻土 硅藻土是一种粘土，通过吸附RNase而去除其降解RNA的作用。,（三）RNA提取方法 RNA提取的常用方法有：（1）表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法；（2）胍盐提取结合氯仿-酚抽提法；（3）胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。,第一种方法所提取的RNA纯度高，反转录（RT）-PCR扩

14、增的特异性好，缺点是操作繁琐，易造成微量标本的丢失或标本间的交叉污染，还易因RNA降解而影响测定结果的可靠性及敏感性；,第三种方法较为方便省时，不需氯仿-酚抽提，但对玻璃粉、二氧化硅等的质量有要求；第二种方法虽较为复杂，但结果稳定性最优，因为使用强烈变性剂加盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破环而从核酸上解离下来。,RNase可耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L硫氰酸胍和-巯基乙醇等还原剂所灭活，因此可联用上述试剂从组织中提取完整无损的RNA。下面以血清（浆）的异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚说明RNA常用提取方法。,异硫氰酸

15、胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法,异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法,（1）试剂20%PEG 6000裂解液：4mol/L GuSCN,25mmol/L柠檬酸钠pH7.0,0.5%Sarkosyl（十二烷基肌酸钠）100mmol/L-巯基乙醇饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）3mol/L NaAc PH5.2无水乙醇75%乙醇DEPC处理的无菌去离子水RNasin（RNA酶抑制剂）,（2）操作步骤200l血清（浆）加入200l 20%PEG 6000 43小时，12000rpm离心15分钟（4），弃上清加入500l裂解液混匀,加入50l NaAc、500l饱和酚：氯仿:异戊醇溶液

16、混匀，冰浴10分钟412000rpm离心5分钟取上层水相再用氯仿-异戊醇抽提一次加入1/10体积NaAc溶液、2.5体积无水乙醇冰浴30-60分钟,414000rpm离心10分钟弃上清沉淀用75%乙醇洗一次 烘干或真空干燥用10l DEPC处理水溶解，加入2u RNasin-20保存备用,三、核酸提取的改良方法（一）旋转离心柱（SPIN COLUMN）提取,旋转离心（SPIN COLUMN）技术是从生物样品中分离纯化微量核酸的较为简便的方法，属于硅吸附方法的一种。是美国和欧洲的科学家们从20世纪80年代未起开始研制的一种微量快速的核酸分离纯化方法，,其克服了传统核酸纯化方法的缺陷，适合于现代分

17、子生物学工作需要进行大量微量核酸分离纯化的工作特点。在美国，旋转离心柱技术出现在90年代初，以后逐渐被市场和技术工作人员所接受，成为微量核酸分离纯化的主导技术。,旋转离心柱技术能够快速、简便地从生物样品中分离纯化包括人体DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA在内的各类脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）大分子。尽管在市场上所见到旋转离心柱各有特色，但是在原理上现行的旋转离心柱系统通常可分为三个部分：,第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则

18、不相亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。,旋转离心柱技术的一次操作过程一般在10分钟到20分钟不等，比传统纯化方法的操作时间（几个小时）大大减少。旋转离心柱纯化的DNA产物的OD260/OD280一般在1.80-2.00之间；分离纯化效率在80%-100%之间。目前，旋转离心柱技术已广泛应用于细胞核DNA、细菌DNA、质粒DNA、细胞MRNA、胶上DNA或RNA等核酸的纯化,核酸载体的膜化是旋转离心柱技术工业化使用的重要基础。随着微量核酸分离纯化技术的出现，操作的简便性、稳定性和重复性一直是围绕核酸分离纯化技术应用的核心问题。为了推出简便、稳定和重复性

19、好的旋转离心柱产品，旋转离心柱技术中的核酸载体先后用过玻璃珠和藻胶等各种材料，直至20世纪90年代初才最后确定为人工膜。,膜化后的旋转离心柱产品具有操作简便、稳定、储存方便、重复可靠等特点，成为核酸纯化市场的主导产品。,旋转离心柱技术的适用性很广，可用于全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、唾液、痰尿、粪便、软骨、动植物组织等各种样品的核酸提取。,（二）玻璃粉吸附法 DNA或RNA可特异地吸附于玻璃粉上，因此将玻璃粉悬液与临床标本混匀、离心、洗涤玻璃沉淀，即可从玻璃粉上获得纯化的核酸。,Yamada等为简化使用PCR检测病原体的核酸提取方法，使用玻璃粉悬液直接从人外周血单个核细胞（PBMC）和血

20、浆中提取核酸，这样得到的核酸标本用于DNA和RNA的扩增检测，得到满意的结果。其提取方法分述如下：,1从细胞提取核酸试剂 1%SDS（含10mmol/L EDTA）4mol/L NaCl玻璃粉悬液乙醇洗涤（50%乙醇，10mol/L Tris,pH7.4,1mol/L EDTA,50mmol/L NaCl）,(2)操作步骤人外周血单个核细胞（PBMC）（2105）加入50l1%SDS（含10mmol/L EDTA）加入150l4mol/L NaCl及50l玻璃粉悬液混匀，置冰浴5分钟10000rpm离心1分钟，倾去上清液,用300l乙醇洗涤液洗沉淀物3次 加入100l水 3分钟洗脱DNA，离心

21、上清液即为含纯化DNA的核酸标本,2从血清（浆）中提取用于RNA检测的核酸（1）试剂6mol/L GuSCN玻璃粉悬液无水乙醇,2）操作步骤 200l血清（浆）加入200l6M异硫氰酸胍及20l玻璃粉悬液 室温90分钟10000rpm离心1分钟，弃上清液 沉淀用300l乙醇洗2次沉淀物中加入50l反转录反应缓冲液，将RNA先转录为CDNA，再进行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。,（三）二氧化硅（SE）或硅藻吸附法 除了玻璃粉以外，SE和硅藻（单细胞藻类的化石细胞壁，D）颗粒也具有特异吸附核酸的特性。Chaotropic试剂硫酸氰胍兼具细胞裂解及核酸失活两种

22、特性，因而在高浓度硫氰酸胍存在下，从细胞（包括细菌）或病毒颗粒中释放出的核酸万分可结合于SE或D颗粒上,BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D颗粒的上述特性，成功地从血清、尿液以及细胞中纯化了DNA和RNA，可在不到1小时内完成12个不同临床标本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D两种提取方案，Y/SE方案为使用SE以提取血液和尿液等体液中的核酸；Y/D方案为使用D颗粒以提取细胞中的核酸。,1、Y/SE方案（1）试剂 裂解缓冲液L6：120g GUSCN溶于100ml 0.1mol/L Tris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/L EDTA,PH8.0(用NaOH调节)溶液22 ml 及2

23、.6g Triton X-100.洗涤缓冲液L2:120G GUSCN溶于100mL 0.1 mol/L Tris-HCl,pH6.4,为使GUSCN溶解加快,可在6065水浴下搅拌,(2)操作步骤50l血清或尿液加入900l裂解缓冲液L6及40l SE 立即旋转混匀，5秒，室温10分钟旋转混匀5秒，离心（12000g）15秒用洗涤缓冲液L2将沉淀洗涤2次,再用70%乙醇洗2次，用丙酮洗1次 去掉丙酮，反应管开盖56干 燥10分钟 加入洗提缓冲液TE 混匀，56干燥10分钟12000g离心2分钟上清液即含纯化的核酸,使用上述Y/SE方案，可以从血清或尿液中高产量地（通常超过50%）提取单链、双

24、链、共价闭合或开环的DNA或RNA，其可作为限制性内切酶、DNA连接酶、反转录酶、大肠杆菌DNA多聚酶和TAQ DNA多聚酶的良好基质。,该方案虽适用于病毒及革兰阴性菌（如脑膜炎球菌、伤寒杆菌、淋球菌等）的基因组核酸提取，但不能直接从革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌、链球菌或酵母菌等）中提取核酸，原因可能是由于硫氰酸胍不能很好的裂解革兰阳性菌。,此外，在提取用于HBV-DNA检测的血清核酸标本时，由于HBV-DNA的长负链5未端共价结合有蛋白质，而GUSCN不能将此蛋白从HBV-DNA上去掉，因此在上述提取方法中，由于有HBV-DNA结合蛋白的干扰，HBV-DNA难以从SE颗粒上洗脱下来。,为解决

25、此问题，作者对上述方法分别作了两种改良，称为H方案和Y*方案。H方案是首先用SDS-蛋白酶K处理血清，使HBV-DNA长负链5未端蛋白脱落，然后再按上述方法提取。,Y*方案是在用低盐TE溶液从SE颗粒上洗脱HBV-DNA时，在TE溶液中加入蛋白酶K，使HBV DNA从SE上脱落下来。这两种方案都可重复地从人血清中获得相同时的HBV-DNA，与用经典方法提取的DNA一样，可作为PCR的良好的检测标本。,2、Y/D方案 该方案与上述方案基本相同，所不同的是使用颗粒较大的D取代SE，以提取相对量多（1020g）的细胞基因组核酸，因为如使用SE，由于DNA分子多，一个SE颗粒可与数个DNA分子结合，从

26、而在SE颗粒和DNA分子之间形成密实的网状结构，而成为聚集物，,即使是高速旋转也难以使其散开，使得核酸提取的后续步骤无法进行。而D颗粒较SE颗粒大得多，在D和核酸分子之间不会形成密实的结构，经旋转很容易散开,（四）微量全血核酸提取法 一般用于全血核酸提取的方法常需较大量的血液标本，难以适于患儿，为此Loparey等于1991年提出了一个使用NaI的微量全血核酸提取法。,1、试剂6mol/L NaI氯仿：异戊醇（24：1）异丙醇和37%异丙醇TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCI,pH7.0+1 mmol/L EDTA,2.操作步骤 抗凝全血（10100l）加入等体积6mol/L NaI

27、旋转1020秒加入等体积氯仿：异戊醇 旋转1020秒离心5分钟，取出水相加入0.6体积异丙醇 混匀3分钟后离心用37%异丙醇洗涤核酸沉淀物用10100l TE缓冲液溶解沉淀,上述使用NAI的提取方法快速，只需30分钟在一个微离心管内就可完成整个过程，从每ml血液中可提取4050g核酸,（五）其它 Porter等1991年报道了一各步需要使用异硫氰酸胍、氯仿和苯酚等有害化合物的血清病毒RNA快速膜提取方法。疏水性Immobilin-P膜有很高的蛋白结合能力，而去垢剂如Tween 20和蛋白酶 K消化膜结合的病毒颗粒，,于是核酸从衣壳中释放出来，同时存在于标本中的RNA酶被失活。由于上述膜的亲蛋白

28、疏核酸特性，从病毒颗粒中释放的核酸留在溶液中，而蛋白则吸附于膜上。,在溶液中加入相应的引物对，即可进行反转录及其后的PCR扩增周期。这种膜提取方法较常规的病毒RNA分离技术简单、快速、敏感，可在100l血清中测出RNA病毒的6.5空斑形成单位，这种敏感性适用于仅产生低水平病毒血症的RNA病毒（如HCV RNA）的检测。,此外，近年来一些用于核酸提取的仪器正进入基因扩增检验领域，Roche的MagNA pure LC全自动核酸提取仪、病因ABI公司的ABI PRISMTM 6700全自动核酸提取仪和PRISMTM 6100核酸提取仪等。这些核酸纯化仪基本上都采用硅吸附方法，,如MagNA pure LC全自动核酸提取仪，采用的吸附颗粒为表面包有一层硅的磁性微颗粒。全自动核酸提取仪器的应用，不但降低了核酸提取的劳动强度，而且减少了核酸的手工提取中容易出现的操作失误，增加核酸提取的一致性和重复性。,谢谢大家！,