生物制药 第四章课件.ppt

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1、2010年6月生物制药,温州医学院生命科学学院王慧利,内容,第一章绪论第二章 生物药物概论 第三章 生物制药工艺学第四章 基因工程制药第五章抗体工程制药第六章 动物细胞制药 第七章 植物细胞制药第八章 酶工程制药 第九章 海洋生物制药 第十章 利用现代生物技术改造传统制药工业,第四章 基因工程制药,第一节 基因工程概念，历史和基本原理第二节 基因工程用到的酶，载体第三节 基因工程技术环节和常用技术 1目的基因获得 2目的基因与载体连接 3 外源DNA导入细胞 4 重组子的鉴定和筛选 5 常用技术 第四节 基因工程在制药中的应用 1 重组药物 2 转基因动（植）物,（一）基因工程（gene en

2、gineering）的概念 又称为遗传工程、重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。按目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和动物基因工程。基因工程具有广泛的应用价值，为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法。基因工程还可应用于基因的结构，功能与作用机制的研究

3、，有助于生命起源和生物进化等重大问题的探讨。,第一节 基因工程概念发展历史和基本原理,基因工程有两个重要的特征 第一是可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；第二是某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。,基因工程诞生的意义：基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流;在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了 新的领域、注入了新的方法;为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景

4、.,1 基因工程诞生的理论基础（理论上的三大发现）（1）40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；（2）50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题；（3）50年代末期和60年初，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。,（二）基因工程发展历史,1）限制性内切酶和DNA连接酶的发现 1970年当时在Wisconsin大学的H.G.Khorana实验室的一个小组，发现T4DNA连接酶具有更高的连接活性，有时甚至能催化完全分离的两段DNA分子进

5、行末端的连接。1972年在旧金山H.W.Boyer实验室首先发现的EcoRI核酸内切限制酶具有特别重要的意义。Hind的发现打破了基因工程的禁锢，1967年在世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。2）载体的发现 因为多数重组DNA片段不具备自我复制的能力，需要一个运送重组DNA分子到细胞中去的车子载体（vector），载体是特定的能自我复制的DNA分子。3）逆转录酶的发现1970年，Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶,打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。,2 技术上的三大发明,DNA分子切割与连接技术的建立构成现代基因工程的技术核心!,（1）在70年代，将外源

6、DNA分子导入大肠杆菌的转化现象获得成功，1972年斯坦福大学的S.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的DNA,从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受体。不到四年，世界上第一家基因工程公司“Genetech”注册登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。(2)1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和DNA重组的DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并因此与W.Gilbert,F.Sanger分享了1980年度的诺贝尔化学奖(3)1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因

7、）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。(4)Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。(5)Berg P、Cohen和Boyer等人的工作在世界上最早实现了DNA体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和产业基因工程的诞生。,3 基因工程技术的建立,4 DNA测序技术的建立进一步促进了基因工程的发展,在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和

8、改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G

9、、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。,（三）基因工程基本原理和流程,按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，利用限制性内切核酸酶和连接酶的性质，对基因片段和载体质粒进行切割和连接，建成重组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状,第二节基因工程中常用的工具酶和载体,一、限制性内切酶 基因工程中常用

10、作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。,（一）基因工程中常用的工具酶,限制性内切核酸酶(restriction enzymes),能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。功能：与甲基化酶一起降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染，是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。,限制性内切酶分类,第类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性第类限制性酶：能识别一段特异

11、的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列A：形成粘性末端产物：识别的序列是对称的，即在一条链中从5到3方向的序列，与其互补链从5到3方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)（EcoR）B：形成平端产物：另一类酶，如Sma，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(blunt ends),限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）,EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组,平齐末端（Sma）,限制性内切酶的命名,属名种名菌株类型发现的顺序,DNA聚合酶的特性,该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5-P 与另一也

12、带相应缺口的DNA片段的3-OH 连接起来,三、DNA连接酶,3,5,5,3,OH,P,P,OH,3,5,5,3,O,P,P,O,DNA连接酶,不匹配黏端的连接 先补平或修平后再连接,3,5,5,3,补平,修平,Klenow,(S1或Klenow),（二）基因工程载体,载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具 克隆载体克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 表达载体将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 插入型载体将外源基因或DNA插入其中 置换型载体切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。,载体必须具备的条件,1、能自我复制

13、：能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 2、多克隆位点：载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）3、克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 4、载体上要有报告基因或选择标记基因，以便进行重 组体筛选和鉴定 5、在细胞内稳定性高且多拷贝。保证重组体稳定，高效传代而不丢失,一、质粒载体 质粒是一种存在于细菌细胞质中，独立于细菌染色体而自然存在的，在细菌体内能进行自我复制、易分离和导入的DNA环状双链分子 质粒大小相差很大（从小于1Kb到大于500Kb），都有一个复制起点。亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定地共存，称为质粒

14、的不亲和性。只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范围质粒；可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿主范围质粒。,严谨型质粒每个细胞中有1-2个拷贝，具有自身传递能力，分子量大。松弛型质粒每个细胞中有10-100个拷贝，不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用此类质粒。常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。,克隆载体,表达载体,基因工程制药的关键技术,获得目的基因，构建重组质粒,产物分离纯化,构建基因工程菌或细胞,培养工程菌,半成品和成品鉴定及包装,除菌过滤,基因工程制药流程：,上游技术,下游技术,上游DNA重组设计,下游的

15、操作工艺和设备,原则,简化,一、基因工程菌的上游构建包括外源基因重组、克隆、表达的设计与构建,（一）PCR的原理和应用,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,1原理,特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程,（Mullis，1984）,第三节基因工程技术环节和常用技术,（一）PCR的原理和应用,（1）变性（denaturation）：模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。,（2）退火（annealing）：温度下降，变性DNA复姓，使寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。,1原理,（3）延伸（extension）：在适宜条件下

16、（包括DNA聚合酶和核苷酸单体），引物3 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。,（4）重复变性、退火和延伸三步操作：DNA片段呈2的指数增长，在12小时内重复2530次循环，扩增的DNA片段拷贝数可增加至106107倍。,2.PCR技术的关键酶-DNA聚合酶,（1）Klenow聚合酶（大肠杆菌DNA聚合酶片段）,（2）Taq DNA聚合酶（水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离，1988年萨奇（R.K.SaiKi）,（3）pfu DNA聚合酶（火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离）,（4）Vent DNA聚合酶（Thermococcus lito

17、ralis）,（二）目的基因的获取,利用PCR克隆目的基因1、常规的PCR2、反向PCR（inverse PCR,I-PCR）克隆基因组DNA片段，I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用的引物与正常的PCR引物方向相反 3、反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)合成cDNA RT-PCR是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再复制成双链DNA,基因的人工合成 如果已知某基因的核苷酸序列，或者通过基因产物的氨基酸序列推导出基因的核苷酸序列，就可将单核苷酸或寡核苷酸一个一个缩合起来，成为一个基因的核苷酸序列。连接的两个分子各有一端被

18、封闭。先合成分别属于双链序列的8-12碱基的片段，两个片段的对应部分配对后留有粘性末端，第三个片段再连接上去，不断延伸直至全部合成,（二）载体与基因的连接 常用的连接方式有：粘性末端连接法、平头末端连接法、人工接头连接法、同聚物加尾连接法。（一）粘性末端连接法 相同限制酶切位点连接法同一的限制酶切割不同DNA会产生相同的粘性末端，在连接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二酯键而连接起来,平头末端连接法、人工接头连接法、同聚物加尾连接法。,RT-PCR,反向-PCR,化学转化法 利用氯化钙诱导细胞（原核）进入感受态，外源DNA直接与感受态细胞混合，处于感受态的细胞可以吸收外来的DNA。

19、电转移法 受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞,（三）外源DNA转入细胞（基因转移）,不需载体的基因转移,脂质体介导法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构 形成囊状结构可将DNA包在其中 带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的 血影细胞介导法 血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构 血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞 磷酸钙沉淀法 细胞具有摄取磷酸钙沉淀的

20、双链DNA的能力 将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐，生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中 由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞，DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核，整合到受体细胞的染色体上,Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems,化学试剂介导基因进入细胞,非病毒载体,聚次乙亚胺,脂质体包埋法,非病毒载体,主要是以重组的动物病毒和逆转录病毒直接感染受体细胞，把外源DNA引入 转导作用：通过噬菌体和病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程。逆转录病毒的特点：病毒基因组为单链RNA，感染期间为双链

21、DNA DNA能整合进细胞并复制 DNA在动物通过生殖细胞传递到下一代；带有对复制有重要意义的基因：gag（结构蛋白）、pol（DNA聚合酶）、env（被膜糖蛋白）,借助于载体的基因转移,腺相关病毒,3 其中最被看好的是腺相关病毒 病毒基因组很小，如2型腺相关病毒是由4681个核苷酸组成的单链DNA，AAV可感染分裂期及静止期细胞，当辅助病毒不存在时，AAV能整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性，免疫原性弱，因此，它无毒高效，是目前理想的基因治疗载体。,（四）重组体的鉴定与筛选一、根据重组子遗传重组表性改变检测法 1、抗性筛选法 利用载体上的抗性基因对阳性克隆作初步的筛选。如pUC19质粒

22、中有Ampr 基因，为宿主细胞提供氨苄青霉素抗性。将转化后的细胞涂布在含氨苄青霉素的培养基中培养 大部分受体细胞没有外源DNA导入，其本身又没有Ampr 基因，所以在培养基中不能生长。在含有外源DNA的受体细胞中，只有含有质粒自连或者质粒与目的DNA形成重组子的受体细胞由于含Ampr 基因，能在培养基中生长。,2、根据报告基因筛选克隆子对于那些不宜采用克隆载体选择标记筛选克隆子的宿主细胞，往往在目的基因连入载体之前，先在目的基因的上下游连接一个报告基因，这样导入宿主细胞后可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。,3、插入失活选择法 当外源DNA插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种现象

23、称为插入失活。例如，pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamH和Sal两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。例如，a-互补使菌产生颜色来筛选,（五）转化子-核酸分子鉴定法1）琼脂糖凝胶电泳法：根据重组DNA分子的大小，其迁移率的差别进行鉴定,2）限制性内切酶分析法：根据片段的大小和酶谱特征与预计的重组DNA酶谱特征比较。,3）印迹杂交法 Southern blot(Southern印迹试验)原理利用硝酸纤维薄膜（或滤纸、尼

24、龙膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝胶电泳，并将凝胶电泳的DNA区带吸附到膜上，然后在膜上进行同位素标记探针与被测样品只间的杂交，在通过放射自显影对杂交结果进行检测。Northern杂交：制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总的RNA杂交。若出现明显的信号，可以认定进入宿主细胞的目的基因转录出相应的RNA,4）原位杂交：可分为克隆和噬菌斑原为杂交，二者的原理相同：转化后得到的菌落和噬菌斑转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，可得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品，进行菌落裂解、DNA变性、中和、接下来用放射性核素标记的探针进行杂交，洗涤移去多余的探针，将滤膜干燥后放射自显影，可得到杂交

25、阳性的菌落或噬菌斑。5）蛋白质印迹方法western blotting：SDS-PAGE-转膜-与放射性核素或非放射性标记物标记的抗体结合，通过抗原抗体结合反应，在杂交膜上显示出明显信号，表明宿主中有目的基因的表达,4）PCR法,6）序列分析法 测序分手工测序和自动测序。手工测序有双脱氧测序法和化学测序法，前者广泛使用。自动测序可用全自动化的DNA序列测序仪准确快速测定DNA序列。,DNA自动测序 DNA自动测序仪根据Sanger的酶促反应原理，用4种荧光染料标记引物，这4种荧光在受到激光照射时会发出可以辩别的不同颜色。,与 PCR反应类似。反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶,dNTPs,

26、ddNTPs和测序引物；反应过程：变性复性延伸终止,Sanger双脱氧终止法,*,少一个OH,脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较,Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）,ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：34)。,新生链随机终止,G G A T C C G G G A T T C C,模板,C C T,C C T AC C T A G,C C T A G G,C C T A G G C,C C T A G G C C,C C T A G G C C C,C C T A

27、G G C C C T,C C T A G G C C C T A,在链延伸过程中，链终止剂会随机插入，从而导致链延伸的随机终止，形成长短不等的片段，这些片段共同特征是末端是带不同荧光的终止剂。,测序反应：,Sanger测序,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,1 各色荧光的终止剂，可以分别取代相应的dNTP,2 测序反应中，终止剂随机插入导致链终止,3 毛细管电泳（可分辨一个碱基差别），按大小分开，短片段跑得快，会首先被检测到，监测器会检测记录相应得荧光信号4 给出序列,Sanger第二步：荧光检测,1）大肠杆菌基因工程菌的构建突出的优点：遗传背景清晰；能以廉价培养基高速生产和高密度发酵；克隆载

28、体和宿主菌选择范围广。缺点：缺乏翻译后修饰与加工，蛋白质表达信号肽不能被切掉，不能分泌表达，不能糖基化。2）酵母基因工程菌的构建特点：细胞壁厚，转化实验要提取原生质球；对多种抗生素不敏感一般采用某些营养缺陷性遗传标志筛选重组体；外源基因重组到穿梭质粒载体中，利于外源基因在酵母菌中的表达和操作。具有对蛋白质进行加工，修饰、合理的空间折叠等功能，非常利于真核基因的表达。3）哺乳动物细胞工程细胞的构建优点：具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面，最接近于天然蛋白分子；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力具有贴壁生长特性，

29、具有较强的耐剪切力和渗透压力。,（五）目的产物的表达与生产,基因克隆与基因组文库的构建 基因组文库的概念 需要将某种生物全部基因组的遗传信息，儲存在可以长期保存的、稳定的重组体中，以便需要时即可应用。这种保存基因组信息的材料，称为基因文库。当需要某一目的基因时，就可在基因组文库寻找，一般采用核酸探针的方法，从文库中“钓出”某基因。,基因组文库的构建 1DNA片段的制备 分离纯化基因组DNA 用限制酶完全酶切或部分酶切2DNA片段与载体的连接 选择合适的载体 3体外包装和基因组文库的扩增 包装入噬菌体进行感染，或转化使质粒DNA进入细胞 4重组DNA的筛选和鉴定,.,.,.,.,.,.,.,.,

30、.,.,.,.,.,.,.,Enzyme digestion,Introduce DNA into E.coli,Selection on antibiotic-containing medium,Screening by hybridization,Streptomyces DNA,DNA carrying target genes,基因组文库的构建,1 总DNA提取2 随机酶切3 与载体连接4 转化大肠杆菌5 筛选转化子6 转移至96空板7 杂交确定阳性克隆,DFG,HI,第四节 基因工程在医药行业中的应用,（一）重组药物的研究,1 重组人胰岛素Humulin,关于胰岛素：胰岛素是由51个

31、氨基酸组成的双链多肽激素，分子量为5734道尔顿，A链有21个氨基酸；B链有30个氨基酸。是人体降低血糖的唯一激素），重组胰岛素是第一个重组药物蛋白类药物，：（1982年美国批准第一个重组蛋白药物（重组人胰岛素Humulin）优泌林,胰岛素的结构,（一）重组药物的研究,重组人胰岛素由人胰岛素基因在异源细胞中表达出来，和人体分泌的胰岛素结构完全相同，发挥自然来源的胰岛素相同的功能（降低血糖的唯一激素）,技术路线：胰岛素基因（人源，动物源）连接到大肠杆菌载体上，在大肠杆菌中表达出来多肽,1 重组人胰岛素Humulin,胰岛素作为治疗糖尿病的特效和首选药物，到目前为止已经历了三代的历史演变：第一代产

32、品从猪和牛等动物胰脏提取而来。由于异源性过敏反应，该类产品疗效较差，在发达国家已被淘汰，目前该品在我国也仅出现在低端市场。第二代产品为重组人胰岛素。从人类细胞中获取胰岛素基因，然后将其插入酵母菌或大肠杆菌等细菌中进行培养，通过复杂的复性和酶性等现代化生物基因技术生产而成，包括常规人胰岛素(R)、中效人胰岛素（低鱼精蛋白锌胰岛素）、鱼精蛋白锌胰岛素（PZI）和预混胰岛素（30R、50R）等。第三代为胰岛素类似物，通过对人的胰岛素基因进行改构获得。胰岛素类似物起效更快，作用更持久，完全模拟生理性胰岛素分泌模式。,二、基因工程新型药物简介,2 人生长激素（Human growth hormone,h

33、GH）主要用途是治疗侏儒症，临床试验认为对慢性肾功能衰竭和Turner综合症也有很好疗效。3 干扰素(Interferon，IFN)干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是种细胞素。干扰素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病。4 白细胞介素(Interleukin,IL)白细胞介素是一类重要的免疫调节剂。目前已发现的白细胞介素已达15种之多，它们的生物学功能十分广泛。白细胞介素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等)。,5 集落刺激因子（Colony-stimulating factor,CSF）集落刺激因子是一类

34、能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称造血刺激因子或造血生长因子。近年来的研究表明，CSF不仅在造血细胞的增殖与分化中起重要作用，而且也参与对成熟细胞的功能调节，并在宿主抗感染免疫中起着重要作用。CSF在临床上多用作癌化疗的辅佐药物，如化疗后产生的中性白细胞减少症，也用于骨髓移植促进生血作用，还可用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、再生障碍贫血等多种疾病。6 促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）促红细胞生成素是一种由肾脏分泌的重要激素，在病理状态下，与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关，在生理情况下，它能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟。临床上治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治

35、疗肿瘤化疗后贫血。7 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factou,TNF）TNF除具有抗肿瘤活性外，对多种正常细胞还具有广泛的免疫生物学活性，临床上用于治疗某些恶性肿瘤，用于临床诊断。,8 组织型纤溶酶原激活剂（Tissue-type plasminogen activator,tPA）tPA是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解，主要用于治疗血栓性疾病。临床上用于治疗急性心急梗塞，急性肺栓塞。9 心钠素（Atrial natriuretic factor,ANF or ANP）心钠素即心房利钠因子。由于其化学结构属于一种多肽，

36、故又称心房肽（ANP）。心钠素具有较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压的作用。在调节体液容量和浓度、控制血压、维持体液平衡方面起着重要作用，可作为降血压药和利尿药，用于治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿和气喘等疾病。10 重组乙肝疫苗重组乙肝疫苗是以基因工程技术研制的第二代乙型肝炎疫苗（HB），是基因工程疫苗中最成功的例子。除上述介绍的10种主要基因工程多肽药物和疫苗外，还有抗血友病因子、凝血因子、超氧化物歧化酶（SOD）、其他基因工程疫苗等。此外，一大批新型的基因工程和蛋白质工程药物正处在不同的研究阶段并不断涌现出来。,人造血因子：（1）重组人促红细胞生成素，适应症是贫血。1989

37、年上市第一个重组人促红细胞生成素Epogen(Amgen)，现有的5个产品中4个是“重磅炸弹”，Aranesp(Amgen，Epoetin突变体)、Neorecormon(Roche，野生型Epoetin)、Procrit(Johnson&Johnson，野生型Epoetin)和Epogen(野生型Epoetin)，2005年销售合计为91.5亿美元。（2）粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF，适应症是癌症或癌症化疗引发的感染预防和治疗。仅有的3个产品2个是“重磅炸弹”，Neulasta(Amgen,PEG化的GM-CSF)和Neupogen(Amgen,GM-CSF突变体)，2005年销

38、售总额为35亿美元。（3）其他造血相关因子（5个），适应症主要是儿童发育不良以及恶性血液病或糖尿病的并发症。,人细胞因子：（1）干扰素，适应症为慢性病毒性肝炎和某些癌症。1986年第一个重组人干扰素Roferon(Huffman-LaRoche)上市,现有5个同类产品，其中2个（组）为“重磅炸弹”，一是Pegasys（Roche，PEG化的重组人干扰素-2a）,另一组是ScheringPlough的PEG-IntronA/IntronA，2005年销售额合计约21.6亿美元。（2）干扰素，适应症为多发性硬化症（MS）。3个产品都是重磅炸弹，Rebif(Serono，野生型干扰素1a)、Avon

39、ex(Biogen,野生型干扰素1a)和Betaferon/Betaseron(ScheringAG,干扰素1a突变体)，销售额合计40亿美元19。（3）其他细胞因子（4个），包括白细胞介素1、2和11的突变体，适应症为肿瘤化疗引起的血小板减少症、肾细胞癌和慢性肉芽肿疾病等20。,人血浆蛋白因子：（1）重组人凝血因子VIII，适应症是血友病A。最早上市的为Recombinate(Baxter和Genetics,野生型)，现有5个同类产品，最畅销的是Kogenate（Bayer，野生型）及Advate（Baxter，野生型），2005年销售分别为8亿21和6亿美元22。（2）重组人凝血因子VII

40、，仅上市NovoSeven(NovoNordisk)，适应症是血友病和止血，2005年的销售额近10亿美元，2006年上半年销售增长19%。（3）重组人凝血因子IX，仅Renefix(Genetics)1个，适应症是血友病B。（4）组织血浆酶原激活物tPA，最早上市的为Activase(Genetech),现有4个品种，适应症是急性心肌梗死，2005年市场规模为6-8亿美元23。（5）C反应蛋白，适应症是严重败血症，仅Xigris(EliLilly)（6）重组人抗凝血酶（ATryn）是2006年批准的、第一个由转基因动物（羊）生产的重组药物。,融合蛋白：是为数很少的以抑制为作用机理的重组药物，

41、仅有3个。1998年批准的Enbrel(Amgen)是TNF受体和IgG的Fc片段的融合蛋白，含934个氨基酸，适应症为风湿性关节炎，为“重磅炸弹”，近5年的销售额约100亿美元。1999年上市的免疫毒素Ontak（Ligand）适应症是皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），是缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的N端133个氨基酸的融合蛋白。2003年上市的Amevive（BiogenIdec）是LEF-3的CD2与IgG的Fc片段的融合蛋白，适应症是牛皮癣。,(二)利用转基因动物技术进行药物生产,获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转

42、基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物,一般过程,1、目的基因的制备和转基因的方法,目的基因的制备 逆转录合成法 化学合成法 PCR扩增法 基因组文库 转基因动物的方法 显微注射法 病毒载体法 生殖细胞载体法胚胎干细胞法,显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于1%）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。,病毒载体法 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。动

43、物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。,病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。,生殖细胞载体法 包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。,胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。将外源基因导入体外培养的ES细

44、胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，在经杂交育种可得到纯合体，即为所需的转基因动物。,ES细胞-多潜能细胞。,胚胎干细胞介导法,转基因超级鼠1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。,转基因鼠,2004年日本静冈县中小家畜实验场宣布，该实验场和北里大学合作，成功克隆出了体内含有水母基

45、因的转基因猪。在用紫外线照射这头刚诞生的转基因克隆猪时，猪蹄等部位会发出荧光,转基因猪,研究负责人之一、俄勒冈保健科学大学灵长类动物研究中心的杰拉尔德沙滕介绍说，研究人员共对只猴子的卵母细胞进行了转基因处理，接着对挑选出的个转基因卵母细胞进行人工授精，然后把这个受精卵分别植入只代孕猴妈妈的子宫中，结果共有只猴妈妈怀孕。但其中有三只小猴不幸夭折，还有一只未获成功，只有“安迪”不仅产下后身体健康，而且转基因特征明显。,首例转基因猴,完成此项研究的美国俄勒冈保健科学大学提供的新闻公报称，这只名为“安迪”的转基因猴于年月日诞生。它目前健康活泼，与另外两只小猴生活在特制的“公寓”里。此次添加在“安迪”体

46、内的是一种绿色荧光蛋白（）标志基因。美国豪斯耳研究所神经生物研究室主任林曦解释说，“如果动物体内含有这种蛋白，在受到特定波长的光照射时，就会出现特定的荧光”。,C 整合卵受精的技术路线,3 利用转基因动物进行基因药物生产,基因药物生产第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是动物细胞基因工程，第三阶段是转基因动物乳腺生物反应器。,具有以下特点：乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白2530Kg。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性接近天然产品。在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖生产群体。,乳腺生物反应器,4、转基因动物研究存在的问题,转基因动物的低效性 转入基因引起完整基因突变 转入基因表达混乱 病毒转基因对宿主的影响 转基因动物模型与预期不符 乳腺反应器的完善 转基因动物及产品的认可,你接受转基因食品或药物吗？,第四章就到这里了！,