梅毒实验室检测课件.ppt

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1、梅毒的实验室诊断,病原体,为梅毒螺旋体，属于密螺旋体属，苍白密螺旋体苍白亚种(Treponema pallidum subspecies pallidum)苍白亚种 梅毒 苍白螺旋体 地方亚种 地方性梅毒 极细亚种 雅司病密螺旋体属 品他螺旋体 品他病,梅毒螺旋体的生物学特性,1、直径 0.100.15m，有814个致密而规则的 小螺旋，两端尖直。2、原生质圆柱体上紧绕着34根周浆鞭毛，故运 动活跃，运动方式多样。3、G-，但不易着色。Fantana镀银染色呈棕褐色。4、在无活细胞的人工培养基中难培养，生长慢。5、抵抗力极弱，对温度和干燥特别敏感；对青霉 素、四环素、红霉素等抗生素敏感。在干燥

2、条件下不易生存。肥皂水和一般消毒剂以及加温42以上均极易将其杀灭。,梅毒螺旋体,传播途径,性接触是主要的传染途径 未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性 随着病期的延长，传染性越来越小 到感染后2年，通过性接触一般无传染性母婴传播 在妊娠7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘传染未经治疗者，虽已无性传播（病期2年），但妊娠时仍可传染给胎儿病期越长，传染性越小;输血传染间接传播：日常用品、接吻、哺乳、医疗器械等途径（接触部位附有梅毒螺旋体）。,梅毒的分期,梅毒的诊断,梅毒的诊断早期梅毒（一期、二期和早期隐性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隐性梅毒）必须依靠病史、症状及实验检查进行综合分析 梅毒的实验室检

3、查结果对诊断有决定性意义,常用梅毒实验室检测方法,病原学检测血清学检测,病原学检查,取材方法一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液暗视野显微镜、镀银染色法和直接荧光法在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。白色发光，螺旋整齐，运动规律（旋转、伸缩或蛇行运动）,病原学检查的临床意义,病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。如未见

4、到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清学检测方法,梅毒血清学检测分类,非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,原理（抗心磷脂抗体）：人体感染了梅毒螺旋体后，组织受到破坏，释放出来的一种类脂成分，与梅毒螺旋体结合形成完全抗原，刺激机体产生类脂质抗体（反应素）。主要是IgM和IgG混合抗体。抗体产生时间 感染3周-4周，硬下疳出现1周-2周一般在感染后57周（或硬下疳出现后23周）产生。抗体作用无保护作用，治疗监测。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。,原理

5、和方法,反应原理抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见抗原基本成分心磷脂、卵磷脂和胆固醇方法包括：快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)不加热血清反应素(USR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验(VDRL)等。,四种非特异性试验方法比较,RPR/TRUST检测流程,试验前期准备RPR仪(水平旋转仪器)必须滴！试剂 50l移液器、吸头 记号笔、废物缸 工作服 一次性手套、口罩、帽子 生物安全柜,梅毒自动旋转仪,测速:100转/MIN（2转）,检测流程（定性）,加样：吸取50l血清（浆）放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内。加抗原：将抗原轻轻摇匀，用试剂盒提供的针

6、头加1滴抗原。反应：将卡片置梅毒自动旋转仪8分钟立即在亮光下观察结果。,检测流程（定量）,稀释液准备：在圈内加入50l生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。加样：吸取50l血清(浆)与各圈中盐水作系列稀释，并涂布满整个圈内。重复定性试验后两步。,凝集反应强度分级：,3+4+：圆圈内出现中到大的红色絮状物，液体清亮。2+：圆圈内出现小到大的红色絮状物，液体较清亮。1+：圆圈内出现小的红色絮状物，液体浑浊。：圆圈内仅见红色集中于中央一点或均匀分散。,RPR定量试验,中等至大的凝块为阳性（圈4和7）有明确但很小的凝块为弱阳性（圈2和3）颗粒均匀分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）为阴性

7、,临床意义,早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。一期梅毒1年后转为阴性 二期梅毒2年后转为阴性。晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。,假阳性问题,假阳性：非梅毒患者的血清反应呈阳性技术性假阳性由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。生物学假阳性是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性,急性生物学假阳性反应的疾病

8、,风疹水痘传染性单核细胞增多症传染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹,慢性生物学假阳性反应的疾病,系统性红斑狼疮 自身免疫性溶血性贫血盘状红斑狼疮 结节性多动脉炎 类风湿性关节炎 桥本氏甲状腺炎,风湿性心脏病干燥综合征毒品瘾者 慢性肾炎肝硬化老年 麻风(是唯一产生慢性生物学假阳性的感染性 疾病),妊娠的假阳性反应,这是一种生理情况下的生物学假阳性 假阳性发生率较低有报告为0.4%，滴度低。,假阳性问题,梅毒假阳性反应的处理 技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可除外。对急性生物学假阳性反应，应做TPHA（TPPA）等试验进行排除。,前带现象,原理指二

9、期梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果。处理将血清稀释后再进行试验。,血清固定,耐血清性（血清固定）指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。,梅毒螺旋体抗原血清学试验,试验原理,检测血中特异性抗梅毒螺旋体特异蛋白为抗原的抗体（IgG 和IgM）。特异性IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出。,实验方法,梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）梅毒免疫层析法

10、-梅毒快速检测(RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）,TPPA/TPHA原理,TPPA试验原理与TPHA试验基本相同TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒TPHA试验中梅毒螺旋体致敏羊红细胞特点梅毒螺旋体(Nichols株)全抗原,操作步骤,1.试剂准备：试验前将试剂和待检标本恢复到室温。2.加稀释液：每份样本做4孔，加标本稀释液加至微量反应板孔内，第1孔100微升，第24孔各25微升。3.样本稀释：取血清25微升加至第1孔，混匀后取25微升至第2孔，混匀后取25微升至第3孔，混匀后取25微升至第4孔，混匀后弃去25微升。4.

11、加对照液：第3孔加未致敏颗粒25微升，第4孔加致敏颗粒25微升。5.混合：将反应板置振荡器振荡30秒。6.反应：置有盖湿盒，孵育2 h，或放4冰箱过夜观察结果。,结果判断,1.观察加未致敏颗粒的第3孔，不出现凝集为有效试验。2.观察凝集反应强度：分级如下。4+：颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠。3+：颗粒光滑覆盖大部分孔底。2+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环。1+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环。：颗粒沉集孔底，中央形成一小点。一：颗粒紧密沉积孔底中央。,荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）,原理将有完整形态的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter螺旋体制备

12、而成）吸收过的梅毒患者血清形成抗原抗体复合物，再加入异硫氰酸荧光素（FTIC）标记的抗人免疫球蛋白，与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成荧光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应。曾经认为FTA-ABS试验是检测梅毒的“金标准”试验。,TP-ELISA,原理用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。特点本法可用于大规模血清检测。,免疫层析,临床应用,梅毒螺旋体试验的作用是作为证实试验它们可以帮助确定非梅毒螺旋体试验阳性反应是真阳性还是假阳性。一旦这些试验呈阳性，则患者终身阳性。,

13、方法特点,特异性强，敏感性高很少出现假阳性。据统计，在普通人群中，有1%的生物学假阳性发生。如系统性红斑狼疮患者血清可使FTA-ABS试验呈假阳性反应，但大多数病例中螺旋体呈串株状荧光。传染性单核细胞增多症，可能由于嗜异性抗体所致，可使TPHA呈假阳性。麻风患者也可使特异试验呈阳性。,临床意义,作为RPR初筛阳性标本的确证试验。不能作为疗效观察的指标。阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合RPR结果进行诊断。,假阳性问题,存在交叉反应的抗体处理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反应的抗体。,老年人抗体阳性的问题,1、真阳性 2、假阳性：这些老年患者所患的基础疾病可能使机体释放诱导产生抗类脂抗

14、体和/或抗T.pallidum抗体的交叉抗原；,梅毒血清学试验结果解释,梅毒血清学试验结果的临床意义,RPR结果解释示意图,阳性 阴性,TPPA结果解释示意图,阳性 阴性,梅毒血清学试验适用范围,检 测 方 法 样 品 种 类 血清 血浆 末梢血 脑脊液非梅毒螺旋体试验 快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验(VDRL)梅毒螺旋体试验 梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(TP-RT)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫测定

15、试验（CLIA）梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）,梅毒检测策略与流程,对这些实验指标的临床应用中常会出现以下情况：,1）单独用筛查试验（如：RPR试验、TRUST试验等非密螺旋体抗体试验）进行梅毒的诊断。2）认为筛查试验不好，没有临床应用价值，就在临床实践中丢弃它。3）只做确诊试验（密螺旋体抗体试验：TPPA,TPHA，TP-ELISA等），阳性一定就是梅毒现症感染。,策略一采用任何一种非梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛策略二采用任何一种梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛非梅毒螺旋体抗原血清试验：RPR、TRUST、VDRL梅毒螺旋体抗原血清试验：TPPA、TPHA、TP-ELISA、RT、FTA-ABS、CLIA、梅毒IgM抗体检测、WB,以临床诊断为目的检测策略一,以临床诊断为目的检测策略二,梅毒实验室检测策略思考,策略一和策略二比较,小结,根据目的选择检测方法及检测策略。可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。策略一采用任何一种非梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛策略二采用任何一种梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛,Thank YOU,