均相时间分辨荧光技术课件.pptx

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1、均相时间分辨荧光技术,张迎春 Y217190001 翁德英 Y217190032闫利英 Y217190031戎微波,背景简介,原理,应用,展望,目 录,CONCENTS,PART 01,简 介,均相时间分辨荧光（HTRF，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，主要用于高通量药物筛选，是研究药物靶标的理想平台。HTRF技术使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰期；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所有使用的螯合物的产品相比，显著增加了稳定性（可耐受低pH值、金属离子、DMSO、EDTA

2、 等）利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF,Time-Resolved Fluorescence）两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、稳定，实验结果的假阳性率较低,背景简介,镧的发现镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔古斯塔法莫桑德尔（CarlGustafMosander）发现。他从在1803已经发现的

3、铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。,卡尔古斯塔法莫桑德尔（CarlGustafMosander）,镧系元素：lanthanide element 镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素

4、后又找到稀土元素中的三个。镧系元素是5771的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀土元素的成员。,背景简介镧,Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行药物研发。让-马里莱恩（Jean-Marie Lehn，1939年9月30日出生）是法国化学家。他于1987年与Donald Cram和Charles Peder

5、sen因为他的穴状配合物的合成，一起获得了诺贝尔化学奖,让-马里莱恩（Jean-Marie Lehn）,背景简介穴状配合物,穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（EDTA）、溶剂或者温度。从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有

6、损失，因此能按照需要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。,专利号：US Patent US 5,527,684由于在该结构上的贡献，让-马里莱恩在 1987 年获得了诺贝尔奖。,背景简介穴状配合物,PART 02,HTRF技术原理,HTRF技术原理,在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干扰降到最低。时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（

7、Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大的Stokes shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。,一、时间分辨荧光,通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状配合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液

8、中反应时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状配合物结合，许多限制因素都可去除。,一、时间分辨荧光,荧光共振能量转移利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。能量供体被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与能量受体比较接近，可以将能量共振转移到在能量受体上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。将能量供体和能量受体分别与相互作用 的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将能量供体和能量受体拉到足够近的距离，产

9、生能量转移，由于能量受体的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。,二、荧光共振能量转移,荧光共振能量的缺点：然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，其背景荧光较强。解决方法：背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，

10、极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧 光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。,二、荧光共振能量转移,HTRF技术原理 HTRF技术结合了FRET和TRF两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体，是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的FRET。在FRET中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过TRF就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很

11、容易区分出FRET信号。当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体上，发射波长为 665nm。665nm的发射光仅仅由供体引起的FRET产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和 665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。,三、HTRF 技术原理,HTRF 技术的能量供体和能量受体 HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu3+cryptate）（图a）或Lumi4铽穴状化合物（Tb2+cryptate）（图b，未发表结构），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率

12、更高。两者的能量受体均可为 XL665 和 d2。XL665 和 d2 激发波长为620nm，发射波长为 665nm，位于红外光区，进一步降低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。,三、HTRF 技术原理,能量受体：XL665和 第二代受体d2 XL665是一种105 kDa的大型杂六聚体，经过分离后交联，以便在HTRF分析中获得更好的稳定性并保持其光物理特性。与荧光素不同，它与Eu cryptates完全兼容。它是红移的，其发射更可能远离可能的中等和复合干扰。d2 是第二代受体，具有与XL665非常相似的一系列光物理性质，但其特征在于比XL665小100倍的有机结构。

13、作为一个小得多的实体，d2限制了在XL665基TR-FRET系统中有时怀疑的空间位阻问题。这些近红外受体也特别适用于均相测定，因为它们的发射不太可能受到典型复合筛选过程中出现的内在介质或化合物自发荧光的干扰。这些红色受体的特性也使它们适合与铽穴合物结合。此外，由于其发射光谱中有额外的峰，铽隐晶质可与荧光素等绿色受体偶联，在520 nm范围内发射，例如可允许设计具有两个读数的多重测定。,三、HTRF 技术原理,HTRF技术中镧元素与穴状配合物的结合 HTRF中使用四种特定的荧光团形成不同的TR-FRET系统。中心元素能量供体是铕穴合物。这些稀土配合物基分别具有Eu3+离子或Tb2+紧密嵌入的大环

14、。这些离子本身不发荧光;他们需要一个光收集装置（即笼）被激发。与其他发光镧系元素技术中螯合物的功能类似，该笼子作为天线，允许能量收集和转移到离子，最终以特定的荧光模式释放该能量。特别是，这些穴状配合物不受影响许多常规荧光团的光漂白，并且离子几乎与它们的大环化合物不可分离。然而，由于独特的笼状结构，穴状化合物的动力学稳定性远高于这些镧系元素螯合物。稀土螯合物在酸性介质中或存在二价离子如Mn2+时会解离并不稳定，而稀土穴合物在宽范围的化学条件下非常稳定，如在三氟乙酸存在下的反相色谱，并且不受影响通过介质中二价离子的存在。因此，它可以在灵敏度，测定窗口和稳定性方面提高检测性能，同时不会影响HTRF为

15、检测带来的特性和优势。,三、HTRF 技术原理,四、HTRF 技术特点,荧光持续时间更久,低背景，化合物和培养基的干扰小,均相检测，不需要洗板），操作简单,时间选择（时间延迟读取测量），读数稳定24 小时以上，甚至可达 7 天,校正干扰因素,能抵御金属离子对信号的影响，对酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA 比较耐受,HTRF的操作步骤,HTRF实验数据分析,HTRF操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。,HTRF采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。,五、HTRF 技术实验方法,PART 03,应用,HTRF 技术的应用,免疫过程分析 CD16 结合检测 CD32 结合检测 CD64 结合检测,生物过程分析 GST 含量测定 HIS 含量测定 CHO 宿主蛋白含量测定,蛋白修饰蛋白甲基化蛋白乙酰化蛋白泛素化蛋白水解,相互作用分析蛋白-蛋白蛋白-多肽蛋白-DNA蛋白-RNA,HTRF 技术的应用,PPT模板下载：行业PPT模板：节日PPT模板：PPT素材下载：PPT图表下载：优秀PPT下载：PPT教程：Word教程：Excel教程：资料下载：PPT课件下载：范文下载：试卷下载：教案下载：字体下载：,感 谢,在座各位聆听,