荧光探针简介课件.ppt

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1、荧光探针在检测生物体中金属离子方面的应用,有机化学,生物体中的金属元素,Na、K维持细胞两侧渗透压、形成神经冲动；Ca抑制脑神经的异常兴奋，使人保持镇静；Zn对大脑的记忆与思维过程有重要影响；,金属蛋白,(1)含铁蛋白。如血红蛋白、细胞色素C等，前者具有载氧、释氧功能，细胞色素C是电子传递体。(2)含铜蛋白。如血浆蓝铜蛋白和质蓝体，前者参与机体内铜的调节，后者是生物过程中的电子传递体。(3)铁硫蛋白。是一类含铁、硫的天然原子簇化合物与蛋白质链上半胱氨酸结合的金属蛋白，如细菌铁氧还蛋白含Fe4S4原子簇，它是生物体中重要电子传递体。(4)金属酶。具有催化生物体内化学反应的金属蛋白，常常金属离子位

2、于活性中心，如锌酶。,20世纪60年代以来，随着配位化学、生物化学、分析化学等多个学科的发展，出现了一门新的交叉学科生物无机化学。其研究对象是生物体内的金属（和少数非金属）元素及其化合物，特别是痕量金属元素和生物大分子配体形成的生物配合物，如各种金属酶、金属蛋白等。侧重研究它们的结构-性质-生物活性之间的关系以及在生命环境内参与反应的机理。,生物体中参与代谢过程的金属离子，往往以游离态和配合物的形式存在；因此，其金属离子的浓度及其分布情况就成为十分关键的热力学和动力学参数。,如何检测生物体内离子的浓度和分布？,例如，细胞内Ca2+等的检测：1）核磁共振波谱法；2）化学修饰电极（电化学探针）；3

3、）发光蛋白法；4）荧光探针方法（最常用）。引自：科学技术与工程，2004，4（11），948953,荧光探针法 利用某种能与特定目标分子或离子特异性结合，且复合后荧光光谱发生显著变化的探针分子，对细胞样品进行染色，然后在紫外光照射下发射荧光，从而通过显微镜直接观察和测量得到金属离子浓度和分布等信息的方法。,配体与Ca2+络合后，荧光显著增强,引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445,荧光探针方法的优点,灵敏度高（一般用量10-410-5mol/L）；选择性好；可用显微镜直接观察，时空分辨率很高；响应时间短；操作方便、成本低；,测定神经细胞中的Ca2+,引自：Ange

4、w.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445,怎样设计荧光探针？,基本要点：荧光探针分子由识别基团和荧光团两部分键合而成；依据一定的原理进行设计，使探针分子与目标物结合前后的荧光光谱有显著区别。,识别基团,螯合剂类超分子配体,荧光团,荧光增强：1、分子中含有较大的共轭体系；2、分子结构较好的平面性和刚性；3、含有与共轭体系直接相连的供电子基团。荧光减弱：1、仅含与共轭体系直接相连的吸电子基团；2、含有可导致荧光猝灭的基团。,如何使探针与客体结合前后发生荧光光谱的显著变化？,1）光诱导电子转移机理（PET）；2）光诱导电荷转移机理（PCT）；3）荧光共振能量转移机理（FRET）；4）基

5、于其它原理的设计。,光诱导电子转移机理（PET）,荧光探针与Ca2+结合后荧光增强,引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445,与结合后，电子供体的HOMO能级下降，从而供电子能力降低。荧光猝灭消失。,电子供体的基态能级高度处于荧光团的HOMO和LUMO之间。从而，荧光团被激发后，供体电子转移到荧光团的HOMO轨道上，使LUMO轨道上的电子无法通过辐射驰豫回到基态，从而使荧光猝灭。,与Ca2+结合前发生光诱导电子转移（PET），无荧光发射。,正常发出荧光,注意分子结构特点：荧光团与猝灭基团之间一般以非共轭基团相连。,光诱导电荷转移机理（PCT）,识别基团与Zn2+结合

6、后，造成与稠杂环相连的N原子的供电子能力下降，减弱了光诱导电荷转移，从而荧光强度降低，荧光光谱蓝移。,当直接连有供电子基的荧光团和吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。此即光诱导电荷转移（PCT）。PCT效应可以使分子的荧光增强并且光谱红移。,引自：J.Am.Chem.Soc.,2002,124(36),10650,荧光共振能量转移机理（FRET）,以485nm做激发波长时，加入Zn2+前，该分子在518nm附近显示荧光素基团的特征发射；而当加入 Zn2+后，发射峰红移至罗丹明基团的特征发射峰（590nm）。,引自：Anal.Chem.,2010,82

7、,3108,荧光共振能量转移（PRET）是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光团(供体)的发射光谱与另一个荧光团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，则当这两个荧光团间的距离较近时(一般小于10nm)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。,Zn2+的引入加强了供体与受体之间的荧光共振能量转移，导致了荧光光谱的变化。,光合作用中能量在叶绿素分子间传递,基于其它原理的荧光探针,钠离子与大环结合后限制了分子的构象异构，使分子结构具有了更好的刚性和平面性，从而增强了荧光。,引自：J.Am.Chem.Soc.,2005,127,6956-6957,单光

8、子荧光探针的缺点,1、背景干扰较强生物体中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的残基以及某些辅酶也能够被紫外光激发并发出荧光，从而产生背景干扰。2、对生物体的光损伤较大紫外光损伤细胞；非辐射驰豫导致自由基（主要是单线态氧）生成。3、紫外光穿透能力低易被细胞内物质吸收。,双光子荧光（TPEF）探针,双光子荧光（TPEF）在高强度的激光作用下，分子通过一个虚中间态（寿命约10-16s）同时吸收两个光子达到激发态，然后经辐射驰豫发出荧光，回到基态的过程。,由于同时吸收两个光子，在荧光量子产率一定的条件下，双光子荧光的强度正比于激光强度的二次方。,一个物质的双光子吸收能力用双光子吸收截面（2）表示，一个物质的双

9、光子吸收截面越大，其双光子吸收能力越强。2单位用GM表示。,哪些分子具有较强的双光子吸收能力？,1、含有供电子基团（D）和/或吸电子基团（A），且均通过大的体系以共轭方式相连；2、具有以下结构特征：1）D-D 2）D-A 3）D-A-D 4）A-A 5）A-D-A 6）A（-D）3,3、增强供/吸电子基团的供/吸电子能力或增加供/吸电子基团的数目，一般有利于增强双光子吸收能力；,有关构效关系的其它内容，请看：Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,32443266,镁离子被大环螯合后，使与共轭体系相连的N原子的供电子能力下降，从而使双光子吸收截面显著下降。,与镁离子结合后，荧光量子

10、产率并没有明显下降，但双光子吸收截面明显下降，故而荧光势必减弱。,引自：J.Am.Chem.Soc.,2004,126(30),9291,光诱导电子转移（PET）机理,引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,5167-5170,双光子荧光探针的优点：1、生物分子的双光子吸收截面大都很小，故而不会产生背景荧光，从而背景干扰很小；2、长波激发，短波发射，故而穿透能力很强，且对生物体的光损伤较小；3、使用激光聚焦激发，发生荧光的区域大小仅为3，从而可以达到很高的空间分辨率。,荧光探针的制备,采取有机合成方法,荧光探针的产业化,产量小(全球只需要几公斤)；附加值高(约100美元/m

11、g)；投资小(生产车间仅几百平米，通过有机合成进行生产)；技术含量高（小批量生产销售，需要较少的高素质研发、有机合成人员和大批具备专业背景的销售人员）。引自：上海染料，2009，37（5），3950,国内进行相关研究的大学和研究所（部分）,中科院（化学研究所、感光化学研究所、理化技术研究所等等）；高校：中南大学、兰州大学、山东大学、武汉大学、吉林大学、南京大学、华东理工大学、大连理工大学、中山大学、南京师范大学、山东师范大学、湖南大学等等。,国外权威期刊,Angew.Chem.Int.Ed.J.Am.Chem.Soc.Adv.Org.Chem.Chem.Commun.Org.Lett.,Thank you all for comingYou were great audience,