常用分子生物学技术的原理及应用课件.ppt

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1、常用分子生物学技术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application,第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,

2、RNA,DNA,（一）印渍技术 Blotting,首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测,探针技术 probe,将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来,二、印渍技术的类别及应用,DNA印迹技术 Southern blottingRNA印迹技术 Northern blotting蛋白质印迹技术 We

3、stern blotting 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip,（一）DNA印迹技术 Southern blotting,又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。,基本方法,将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作

4、用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,Paper Towels,Southern Blotting,tissue,SDS,蛋白酶K,酚/氯仿,无水乙醇离心,（二）RNA印渍技术 Northern blotting,又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异

5、mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,（三）蛋白质印渍技术Western blotting,又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。,三种印迹技术的比较,（一）DNA印迹技术(Southern blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质

6、定性定量及相互作用研究。,斑点印迹Dot blotting,斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。,原位杂交in situ hybridization,即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。,第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction,PCR技术 polymerase chain react

7、ion,PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本工作原理,模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,二、PCR体系基本组成成分,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,四、PCR的主要用途,（一）目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效

8、方法之一。主要采用的方法有：与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段；利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。,（二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。（三）DNA和RNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时P

9、CR技术,实时PCR技术原理,第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法(Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法(sanger法),一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法),基本原理,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,化学裂解法的示

10、意图,二、DNA链末端合成终止法,目 录,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,目 录,基 因 文 库Gene Library,第 四 节,基因组DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(cDNA library),基因文库(gene library),是指一个包含了某

11、一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,cDNA文库,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes,第 五 节,克隆疾病相关基因的策略,（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate g

12、ene approaches),定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。,（一）功能性克隆,应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。,功能互补试验(functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。,（二）定位克隆,定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析染色体异常(缺失

13、、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆,（三）非定位候选基因克隆策略,由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。,（四）定位候选基因克隆策略,当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。,第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用,The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫

14、，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物,一、转基因技术,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除获得性突变(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型,第 七 节 生 物 芯 片 技 术,Biologic

15、al Chip Technology,DNA芯片(DNA chip)cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),DNA微阵列,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),第 八 节蛋白质相互作用研究技术,Research Technology of Interaction of Protein,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等,常用蛋白质相互作用的研究技术,一、酵母双杂交技术的基本原理,二、酵母双杂交系统的应用,（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用,