基因诊断治疗课件.ppt

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1、1,基因诊断和基因治疗（Gene diagnosis and Gene Therapy）,2,基因诊断,3,概述,几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。,4,基因诊断主要内容一、基因诊断概念二、基因诊断常用技术三、基因诊断策略四、基因诊断在临床的应用 1.在遗传性疾病诊断中的应用 2.在传染性疾病诊断中的应用 3.在肿瘤诊断中的应用 4.在法医学上的应用五、基因诊断存在的问题和发展前景,5,基因诊断的出现：1976年加

2、州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断。,6,狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。,基因诊断的概念,7,核酸分子杂交技术PCR及其衍生技术限制性酶谱分析限制性片段长度多态性分析寡核苷酸探针杂交DNA芯片技术DNA测序技术,二、基因诊断中常用的几种技术,8,(一)核酸分子杂交技术,(1)方法:以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检

3、测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.,9,(2)几种不同形式的核酸分子杂交 a.Southern印迹(southern blot)杂交:用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b.Northern印迹(Northern blot)杂交:用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c.斑点杂交（dot blot):既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低 d.原位杂交（in situ hybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DN

4、A原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类:玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜),10,原位杂交的镜像图,11,(二)PCR技术在基因诊断中的应用,（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交不存在这种突变；只

5、与突变探针杂交-突变基因为纯合子；与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型,12,ASO探针杂交检测已知点突变,受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO 探针杂交,ASO1,ASO2,Normal,Hetero,Homo,13,（）PCR-单链构象多态性（PCR single strand conformation ploymorphism,PCR-SSCP)分析,是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就

6、不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE电泳中表现出不同的迁移率.SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,14,PCR-SSCP分析原理示意,15,(3)PCR-限制性片段长度多态性（PCR restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLP）分析,基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化

7、时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.,16,限制性片段长度多态性 RFLPs(restriction fragment length polymorphisms),1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱,17,(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺

8、点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变,18,变性梯度凝胶电泳图,19,荧光定量PCR(FQ-PCR)技术 是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点.FQ-PCR技术的两种定量形式:绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量.如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确.相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin,rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应体系内是否

9、存在PCR扩增的影响因素.,(6)定量PCR(quantiative PCR,Q-PCR),20,(7）DNA序列测序,1.1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。,21,22,2.自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质,23,（8）DNA芯片技术,DNA芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarra

10、y)该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。,24,基因芯片技术,25,基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。,26,基因表达的分析,27,三、遗传病的基因诊断,

11、一.遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆.2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.,28,二、人类基因组上的DNA遗传标记,限制性片段长度多态性(RFLPs)1985 短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s 单核苷酸多态性(single-nucleotide polymor-phisms SNPs),29,短串联重复序列STRs(short tendem repeats,Microsatellites),STR广泛存在于人基因组，占

12、约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以(CA)n，(GT)n 为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。,30,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记.人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱

13、基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）,31,SNP用作遗传标记具有以下优点：,SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白

14、质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间.,32,四、基因诊断技术在临床的应用,32,33,血红蛋白病的基因诊断,分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断：如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(缬)代替.对该病的基因诊断应采用:1)PCR-限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 印迹杂交分析,3

15、4,HbA、HbS和HbC的密码子及蛋白质区别,珠蛋白基因的第6位密码子有三种形式：正常红细胞的基因A、镰状红细胞的基因S和另一种相对常见的血红蛋白C的基因C。,35,设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密码子，扩增后用Mst限制性内切酶对扩增产物进行水解，通过对水解片段的电泳分析或进行Southern杂交分析可以做出正确的诊断。限制性内切酶Mst识别序列为CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此珠蛋白基因的第5、6密码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发生镰状突变后该酶切位点消失。,36,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变

16、基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,37,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,酶切产物电泳分析,38,酶切产物Southern印迹杂交分析,用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交检测点突变被检靶片段经PCR扩增、酶切，并经电泳分离后转移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交 探针为珠蛋白基因5端的基因片断,39,图示珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子S(SS)和杂合子AS个体的DNA杂交结果,40,PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交PCR产物分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交，根

17、据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点,41,b-珠蛋白基因点突变 GAG(Glu)-GTG(Val)bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC,Hetero,bA probe,bS probe,Homo,Normal,42,（二）地贫的基因诊断：1.定性分析：PCR法直接扩增1和2，基因的3端有差别，针对此可设计引物进行PCR，如有缺失，则不能扩增出产物。2.定量分析:地贫的共同特点是珠蛋白mRNA的量减少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊断。,43,重型地贫:胎儿水肿综合征 早产死胎或出生

18、前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法,44,基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,地贫的Gene诊断,45,以Gene为探针，Southern blot 方法检测,/-/-/-/-正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,46,（三）-地贫的基因诊断 1.DNA检测与分析：PCR-ASO 探针法为主要方法：根据-珠蛋白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生突变的2个片段,再分别与相应野生型探

19、针和突变探针进行斑点杂交。PCR-RFLP连锁分析法：检测与-珠蛋白基因连锁的遗传标记进行基因诊断,如-珠蛋白5端有一限制内切酶HgiAI的多态性位点,在中国人群的频率为0.5 DNA芯片技术 2.RNA检测与分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊断,47,杜氏肌营养不良症的基因诊断(Duchenne muscular dystrophy,DMD),DMD：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变(突变或缺失)。其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMD患儿在5岁前发病，20岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500。,48

20、,DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。Gene 定位Xp21，Gene 2300kb,79 个Exon，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa，分子量427kD。DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。,49,杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断,多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）P1 除外显子1 外其余均缺失；P2 外显子819 有小的缺失；P3 外显子44-50 缺失；P4 外显子4552 有小的缺失；B1 空白对照；C1、C2 正常

21、对照。,50,临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,成年型多囊肾病的基因诊断APKD，AD,51,以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交Southern Blot杂交 Gene组DNA probe（3HVR）PvuII酶切 DNA片段 杂交 结果,52,结 果,1 2 1 2 3 4

22、5 57kb 34kb 23kb,53,结果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.,54,甲型血友病的基因诊断,血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/50001/50000。为甲型血友病和乙型血友病。,55,已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。PCR 142 bp BcLI 142bp+99 bp+43bp 电泳 结果分析？

23、,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I-,Bcl I+,56,问:1：2、1诊断；2：1是男或是女发病？,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,57,结果分析,1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）1为99bp片段 如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）。,58,肿瘤的基因诊断,肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊

24、断策略.,59,一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤:染色体易位及基因融合是较普遍的现象.如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.,60,二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤,癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤:ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12、13和61位密码

25、子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变.ras癌基因点突变检测方法:a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。b.PCR-SSCP法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。,61,2.P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有p53基因突变。突变类型：130290密码

26、子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。基因检测方法：PCR-SSCP:可检出有无突变 PCR-RFLP:通过内切酶位点的消失或增加 检测p53的基因突变。,62,三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤,已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:,63,四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤,肿瘤标志物（tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。类型：基因标志：是指基因本

27、身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。基因诊断方法：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。,64,感染性疾病的基因诊断,每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是DNA,也可以是RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因.一.病毒感染性疾病

28、的诊断 a.乙型肝炎病毒:目前采用免疫法检测血清中病毒抗原.HBV基因组包含4个开放阅读框,S、C、P和X区,C区变异性小,是基因诊断采用的目标部位.在用PCR检测时可扩增HBV的特异核苷酸序列,通过PCR产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或Southern印迹等结果作出判断.也可采用基因芯片技术.,65,PCR 检测HIV 病毒携带者,66,b.传染性非典型肺炎(SARS):是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)感染引起.SARS-CoV基因组为正链单股RNA,有11个开放阅读框,基因组的特异保守序列为编码RNA聚合酶的序列.基因诊断方法:采用RT-PCR技术扩增保守序列 DN

29、A芯片二.诊断细菌感染性的疾病 用PCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物,检测引起的疾病的细菌类型.,67,基因诊断方法在法医学上的应用 微卫星核心区重复序列的拷贝数的差异是微卫星DNA多态性的主要成因，微卫星的侧翼序列多是相对保守的非重复序列，因此可以设计特异性引物，用PCR技术检测微卫星DNA的多态性。人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体DNA作southernblot，同一个体的不同组织来源的DNA谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种southern印迹图被称为DNA指纹。,68,PCR-STR 技术在法

30、医学中的应用,69,基因诊断用于亲子鉴定,70,DNA指纹分析用于个体鉴定,71,基因诊断意义,现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生,72,基因诊断存在的问题与发展前景,一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性.3.伦理问题二.发展前景,73,结束语,基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断.基因诊断的基本技术是核酸分子杂交和PCR扩增.

31、前者是最直接、最准确的基因诊断技术,后者则是应用前景最为广阔的诊断技术.目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术的不断发展,基因诊断技术将会更加广泛.,74,基因治疗Gene Therapy,75,基因治疗（Gene therapy）,基因治疗（Gene therapy）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。,为达到这一目的，实施相应的策略。,76,基因治疗三要素,1.合适的目的基因：补充缺损基因；矫正异常基因；其他具有治疗作用的基因。2.合适的基因转移方法。3.必须在体内正常

32、表达：基因表达调控机制。,77,基因治疗流程,1.确定病因（致病基因）2.治疗基因的获得：DNA重组3.将治疗基因导入基因治疗靶细胞靶细胞：体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、寿命长等条件）导入方法：物理法、化学法、融合法、病毒载体法4.将治疗基因修饰的靶细胞回输体内5.观察治疗效果,78,本章内容提示,基因治疗(gene therapy)概念基因治疗策略治疗靶细胞：体细胞、生殖细胞的基因治疗基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应,79,一、基因治疗策略 策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的

33、。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）,80,2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而 对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,81,途 径:,就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,82,1、生殖细胞基因治疗,将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。,83,但还存在某些问题：,1

34、）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,84,2体细胞基因治疗somatic cell gene therapy,将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,85,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达

35、 即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。,86,存在的问题,对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；随机插入可能引起后代的基因突变。,87,二、基因治疗的方法,基因治疗的关键性步骤-目的基因的获得与转移,88,基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离 基因克隆 定 位 表 达 评价表达情况,一）目的基因的获得 正常基因的分离与克隆,89,二）外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,90,1）物理方法,（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达

36、。瞬间细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,91,（2）显微注射法（microinjection）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核,92,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射（体外）小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),93,94,clone sheep Dolly体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly卵细胞 去核 细胞,95,（3）微粒子轰击法,利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细

37、胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。,96,2）化学法,磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。,97,磷酸钙+DNA 混合微细颗粒 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h 方法简单，但转化效率低。,98,3）脂质体法（liposome）,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA 细胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,99,4）同源重组法,同源重组（homologus rec

38、ombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。单交换 双交换,100,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xba I,BstXI,Xba I,neo,XbaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,C,重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,101,5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染

39、受体细胞,感染细胞,重组病毒,102,逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体 DNA病毒 1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。,103,104,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol envU3 R U5 U3 R U5 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。,105,逆转

40、录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100%病毒基因和所载的外源基因都可能表达宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,106,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；,107,逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,108,6）受体载体转移法,将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径

41、达到转移基因的目的。,重组质粒,配体,细胞膜,复合物,109,三）靶细胞的选择,靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作；2）易于由人体分离又便于输回体内3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期）4）易于受外源遗传物质转化。,110,常见的靶细胞,外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗肝C家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗肌细胞,111,三、Gene治疗的现状与前景,体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治

42、疗必须具备下列条件：,112,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,113,肿瘤基因治疗临床实践,114,肿瘤基因治疗是应用基因转移的技术将外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正肿瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者通过增强宿主的免疫防御功能杀伤肿瘤细胞，因此，肿瘤的基因治疗也是生物治疗的重要组成部分。,115,目前肿瘤基因治疗仍处于早期阶段，尽管其在体外或动物实验上有许多理想结果，但在临床实践中的应用还面临许多困难，具体问题体

43、现在：如何选择更有效的目的基因？如何确保载体的安全性？如何将带有治疗作用的载体高效率的转移到人体内？如何保持这些重组载体在人体内长期和稳定的高效表达出预定的基因产物？如何有效地将基因治疗与其他治疗方法的联合应用？如何更有效的减轻人体对重组载体的免疫作用？这些都是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难，并成为目前肿瘤基因治疗研究的热点。,116,目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。目前临床上肿瘤基因治疗方式可分为间接体内（回体法）(exvivo)和直接体内（invivo）两种。所谓间接体内法就是将靶细胞由患者体内取出，于体外完成基因转移后再回输患者体内，此种方法的优点为靶细胞明确、转染效

44、率高；而直接体内法是将目的基因插入载体，经修饰后直接注入肿瘤部位或通过血液循环注入体内，在体内完成向靶细胞的基因转移，具有一定盲目性,转染效率低，但较前者简便、费用低，已被越来越多的临床研究所选用。,117,肿瘤基因治疗基因转移方法较多，可分为物理、化学和生物三大类。前两种是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导的转化等。第三种方法为病毒方法，指通过携带有目的基因的病毒感染靶细胞并表达出目的基因的方法。,一、基因转移的方式及所采用的载体,118,二、肿瘤基因治疗的靶向性和目的基因调控的研究,肿瘤基因治疗中目的基因有选择的进入肿瘤细胞等靶

45、细胞（靶向性基因治疗），是治疗成功的关键。近年来，人们对这些方面进行了广泛研究，并提出了许多方案。如通过改进给药途径和方式，或通过修饰载体和基因，均可望提高肿瘤基因治疗的定向性和可控性。,119,1、给药途径：肿瘤基因治疗给药途径中，最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT导向下定位注射。这种方法简单易行，常用于体表的晚期肿瘤。但由于使用时很难达到瘤内均匀分布，虽然有所谓旁观者效应的存在，仍可能使疗效受一定影响。对于盆腹腔肿瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治疗则可采取气管内给药的方式。,120,2、载体构建 构建出能特异结合进入靶细胞的载体是实现肿瘤基因治疗定向性的主要工作，具体研究

46、成果有：（1）利用某些病毒能选择性感染人体特异组织的性能，选择和构建特异性载体。如EB病毒和B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞等。Kenney等以EB病毒为基础，构建出表达胞苷脱氨酶基因的载体，结果显示有无复制能力的载体均可感染EB病毒受体CD21阳性的细胞。（2）利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体。如研究发现VEGF在黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达升高，Li等据此设计了含VEGF受体结合区的多肽，并将之与目的基因相连，可以介导目的基因在表达VEGF受体的细胞特异性转导。,121,3、目的基因的调控 对目的基因的修饰，主要是为了能在局部选择性的攻击肿瘤细胞，即通过构建含有细胞特异性

47、启动子序列的重组载体来调控目的基因定向表达于肿瘤细胞。如AFP启动子对肝肿瘤细胞的选择性等。,122,三、肿瘤基因治疗的常用方法,1、抑癌基因的导入：目前对抑癌基因研究较多的是p53基因。1990年Baker等首先观察到p53导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞出现了明显的凋亡。Roth于1993年应用载有野生型p53的重组逆转录或腺病毒载体进行人体肺癌的实验治疗，出现了8%的部分缓解率，64%病情稳定的效果。美国已从1995年起进行了重组腺病毒p53制品的临床试验。,123,2、癌基因的反义核酸导入治疗 针对癌细胞癌基因异常活化而设计的反义核酸技术可有效调节肿瘤细胞中基因表达。具体应用方法有二：一是利用

48、质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达；二是体外人工合成反义寡核苷酸。由于第二种方法相对简单，故多数反义核酸基因治疗研究均采用了这种技术。反义核酸基因治疗在靶基因选择上，可以分为癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体细胞信号传导系统、细胞周期调控物质、酶类及其它。反义核酸基因治疗不但在体外实验和动物模型上取得了显著效果，临床试验亦显示出良好效果。,124,3、免疫基因疗法：由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗

49、原递呈细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7），或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下三种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态。,125,(1)将某些细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。这些细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治

50、疗研究的最常用方法。,126,（2）由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和（或）共刺激信号表达不足，可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。（3）制备肿瘤DNA瘤苗，即将编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如应用癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA瘤苗在实验中显示出一定的效果。,127,4、自杀基因疗法 将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导