产前诊断实验室技术课件.pptx

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1、1,产前诊断实验室技术,2,主要内容,一、产前诊断基本知识介绍二、产前诊断的取材三、产前诊断主要实验室技术羊水细胞染体核型分析羊水细胞荧光原位杂交,3,为什么要进行产前诊断,围生儿期常见疾病的发生率大大降低遗传性疾病的发生率逐年提高遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚至导致患儿死亡或终生残疾产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生，降低遗传性疾病的发生率,4,产前诊断概念,产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准确判断,5,产前诊断概念,无创性产前诊断技术影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发育情况母

2、体外周血富集胎儿细胞技术母体外周血胎儿游离DNA检测有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病,6,可进行产前诊断的疾病有哪些,单基因遗传病:PCR，基因测序等,7,染色体异常的发生机率,活产婴儿 0.6%先天性智力障碍（MR）患者 23%先天性心脏病 13%死胎和围产期死亡胎儿 6.0%自然流产(前三个月)60%,8,染色体异常的发生机率,21-三体综合征新生儿发病率高达1/80018-三体发病率约为1/800013-三体发病率约为1/20000其它各种性染色体异常发病率约为1/1000,9,哪

3、些人需要进行产前诊断,唐筛高风险孕妇35岁以上高龄孕妇夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新生儿死亡史的孕妇再次妊娠采用辅助生殖技术妊娠者夫妇一方有明显致畸因素接触史者,10,孕期胎儿染色体筛查方案,11,唐氏筛查报告的解读,例如：21-三体风险率1/100假阳性和假阴性结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率:65%，假阳性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以将检出率增加到75%结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率

4、：5%仅仅是筛查实验，不是确诊实验！,12,先天愚型的发生率与母亲年龄关系,13,产前诊断取材,绒毛膜穿刺术羊膜腔穿刺脐静脉穿刺术,14,绒毛膜穿刺术,在妊娠9-11周之间进行一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何产前诊断的需要操作相关的流产率约为1%,15,羊膜腔穿刺术,孕18-24周B超引导下取羊水25-30ml,16,脐静脉穿刺术,操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为最佳穿刺时期其危险性高于羊膜腔穿刺术和CVS,17,产前诊断主要实验室技术,羊水细胞培养及染色体核型分析羊水细胞荧光原位杂交检测（Fluorescence in situ hybridization，FIS

5、H）,18,羊水细胞培养及染色体核型分析,19,羊水细胞培养实验原理,标本采集：一般为孕1824 周，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，较易生长羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的，死亡的，只有一小部分是活细胞人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行传代培养,20,羊水细胞培养实验原理,培养条件：37,5%CO2 开放式培养经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞克隆，此时需更换培养液换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况，适时加入秋水仙素终止培养,21,羊水细胞培养实验步骤,25ml羊水于1500rpm离

6、心10min小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀加入5ml完全羊水培养基，混匀转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37,5%CO2 培养箱中培养57天一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左右行细胞学处理。,22,细胞收获及染色体制备实验步骤,倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化收集细胞悬液：1500rpm离

7、心10min，去上清低渗：加入0.075M KCl 6ml，吸管吹打，37水浴30min预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm离心10min固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀，1500rpm离心10min重复固定一次，1500rpm离心10min，去上清根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片显带、染色，显微镜下分析,23,正常男性染色体核型 正常女性染色体核型,24,21-三体男性染色体核型 21-三体女性染色体核型,25,羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测,原理：经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应

8、位置上发出荧光信号在细胞学水平和分子水平之间架起了一道桥梁,26,荧光原位杂交（FISH）技术,用已知的荧光标记单链核苷酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位,27,羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测,28,FISH技术可检测哪些染色体病,羊水FISH检测技术可快速检测羊水细胞中13、18、21、X、Y染色体数目异常以上五种染色体非整倍体异常发生率占所有染色体非整倍体发生率65%以上，占染色体异常活婴的95%以上,29,

9、FISH试验流程,洗片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察荧光信号,30,图1 A：正常男性核型图；B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y,核型分析与FISH结果,图1A 1B 1C,31,核型分析与FISH结果,图2 A：正常女性核型图；B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X,图2A 2B 2C,32,核型分析与FISH结果,图3A 3B 3C,图3 A：21-三体男性核型图（箭头示三条21号染色体）B：13/21组荧光信号图，绿色示13

10、号、红色示21号（3个）C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y,33,核型分析与FISH技术对比,核型分析优点可检出全部46条染色体不仅能检出染色体数目异常，还能检出染色体结构异常目前仍是诊断染色体病的金标准核型分析缺点孕周要求较为严格，一般为18-24周 需要经过细胞培养，诊断周期长，核型分析报告时间为15-20天 可能发生污染或培养失败等情况,34,FISH技术优点不经过细胞培养，缩短了诊断时间，提高了诊断效率，报告时间为2-3天 对孕周无严格要求操作简便、敏感、特异性强 FISH技术缺点仅能检出部分染色体数目异常不能检出染色体结构重排及变异,核型分析与FISH技术对比,侵入性产前诊断技术的利与弊,35,无创性产前检测技术,36,无创性产前检测技术,37,38,无创性产前诊断技术,39,无创性产前检测技术的利与弊,产前诊断新技术,高通量基因测序染色体微阵列（CMA，SNP-array）分辨率高，是普通核型分析的20倍可检出重复或缺失序列的来源不能检出染色体平衡性结构改变不能检出重复或缺失序列在染色体组中的位置,41,产前诊断的重要性,42,本节知识回顾,产前诊断的概念产前诊断的主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析羊水细胞荧光原位杂交,43,谢谢!,