中医药研究常用分子生物学技术课件.ppt

《中医药研究常用分子生物学技术课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中医药研究常用分子生物学技术课件.ppt（108页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第二章 遗传物质及遗传信息的传递,除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。DNA遗传信息的传递中心法则遗传信息从DNA到RNA转录遗传信息从mRNA到蛋白质翻译,DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系。,第一节 DNA的变性、复性和DNA杂交,一、变性(denaturation)在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为变性。变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部的双螺旋阶段上。DNA变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。引起DNA变性的因素有：酸、碱（PH=11.3）、热、某些变性剂（如尿素

2、、胍）和某些有机溶剂（如乙醇、丙酮）等。,二、复性（renaturation）,变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程称为DNA复性或退火。复性可分为两个阶段：首先是成核（nucleation），然后是拉链式(zippering)。复性开始时,两条DNA单链随机碰撞形成局部双链，如果是正确的互补区形成的碱基对，就成核（1020bp）。如果不是正确的互补区，就解开，继续碰撞。成核后，两条单链的其余部分碱基就像“拉链”哪样完成整个复性过程。,DNA复性速度受多种因素影响：,DNA大小与信息的多少：DNA片段小的比大的容易复性，反之亦然。信息含量少的比多的容易复性。离子强度：通常

3、增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。所以，要保持单链DNA，盐浓度低于0.01mol/L。DNA浓度：DNA浓度越大两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性的速度也就越快。,三、杂交,上述复性DNA中，如果两条链来源不同，这就叫做杂交分子。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序性（不同来源）的单链彼此间有一定程度的互补序列就可以形成杂交链。杂交分子可以在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸单链与RNA或DNA单链之间进行。,第二节 DNA的合成,一、半保留复制DNA复制时，两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板、

4、按碱基配对原则进行互补合成DNA，新形成的每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semi conservation replication)。,1、复制起点和复制子,DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始，这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示。DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。复制起点在DNA内部原核生物只有一个复制子真核生物有多个复制子，每个复制子长约50-200kb。,2、DNA复制的特点,DNA复制的最主

5、要特点（1）半保留复制（2）半不连续复制(Semi-ondisctinuous replication)。在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条链连续复制，为先导链(leading strand)；另一条链不连续复制，形成冈崎片段(Okaxaki fragments)，是后随链(lagging strand)。,二、参与DNA复制的有关物质,模板DNA，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是DNA合成的原料。还需要一些酶参与DNA合成(一)螺

6、旋酶(Helicase)又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开双链。螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。,(二)单链DNA结合蛋白(SSBP),单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。,(三)DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase),DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类：拓扑异构酶，如大肠杆菌的蛋白(MW-110

7、000)；拓扑异构酶，如大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase),螺旋与超螺旋,由于强行分开双螺旋末端而引发产生的超螺旋结构,(四)引发酶(Primase)和RNA聚合酶(RNA Polymerase),引发酶催化引物RNA分子的合成。RNA聚合酶也是催化RNA分子的合成。人们认为后随链前体片段的引物是由引发酶合成的，而先导链的引物是由RNA聚合酶合成的。可能在大多数情况下，两种类型的引物都是由引发酶合成的，而RNA聚合酶的主要作用就是通过转录过程而解开局部的DNA双螺旋。这种作用就称为转录激活(transcriptional activation)。,（五）DNA聚合酶(DNA Pol

8、ymerase),这类酶的共同性质是:1以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;2需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的DNA链;4催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。,1、大肠杆菌DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)这是1956年由Arthur Kornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。,DN

9、Apol I的功能,1聚合作用:在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。235 外切酶活性校对作用：从35 方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。35 3 外切酶活性切除修复作用：从5 3 方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。,大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol),1970年发现了DNApol。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApol的5%。该酶的催化特性如下：(1)聚合作用(2)该酶也具有35 外切酶活性，但无5 3 外切酶活性。(3)该酶对

10、作用底物的选择性较强(4)该酶不是复制的主要聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol),DNA pol 全酶由多种亚基组成 大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子，尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶I、的15倍和30倍。DNA聚合酶是细胞内DNA复制所必需的酶 有聚合作用：从5 3 方向合成DNADNApol也有3 5 和5 3 外切酶活性。,DNA pol 酶的组成,2、真核生物的DNA聚合酶,真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚合酶都没有3 5 或5 3 外切酶活性。主要的酶(占总量的80-90%)是DNA聚合酶，分子量为300K

11、D，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。DNA聚合酶，分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。DNA聚合酶，分子量为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。DNA聚合酶，具有3 5 核酸外切酶活性。,真核生物DNA聚合酶种类及作用,（六）DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。DNA连接酶在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。真核生物细胞中的DNA连接酶有两型：DNA连接酶分

12、子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接酶分子量约85KD，主要存在于生长于不活跃的细胞中(resting cell)。,三、DNA复制的过程,DNA复制过程大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。（一）DNA复制的引发1、前引发过程（1）解开双链：两种方法：螺旋酶在Ori处解开双链通过转录激活解开双链,转录激活：,RNA聚合酶在Ori处转录一段RNA，将双链分开，便于引发体与DNA结合，在先导链模板链上合成引物RNA，这一过程称为转录激活。（2）引发前体（preprimosome)形成单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由复制因子X（n蛋白）、Y（n

13、蛋白）、n 蛋白、i蛋白、dnaB蛋白和dnaC蛋白六种蛋白质形成引发前体,并与单链DNA结合，这一过程叫前引发过程。,2、引发体（primosome)形成,引发前体与引发酶(primase)组装成引发体。引发体可在DNA上移动，在dnaB亚基的作用下，识别DNA复制起点位置。首先在先导链上合成一段RNA引物，然后引发体沿5 3 方向不断移动，在一段距离上反复合成引物（primer)。,（二）DNA链的延伸,DNA新生链的合成由DNA聚合酶所催化。DNA聚合酶在引物3-OH端连上核苷酸，以使DNA新链得以延长。由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。DNA拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋状态转

14、变成松弛状态；而DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。在DNA复制叉处由两套DNA聚合酶在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。,引物的切除：,DNA聚合酶I发挥5 3 外切酶活性，切去引物RNA并填补空缺（缺刻平移），留下的缺刻由DNA连接酶连上。,(三)DNA复制的终止,DNA复制在复制终止位点处终止。1、环形DNA分子的终止在单向复制的环形DNA分子中，复制终止也即它的复制起点。在双向复制的环形DNA分子中，有的有固定的终点，而大多数没有固定的终点。,2、线性DNA复制的终止,由于引物RNA的水解，两个子代分子中，各有一个5 端缺少一段核苷

15、酸，而没有一个DNA聚合酶能填补。（1）T7DNA：形成连环分子（concatemer)T7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，这叫末端冗余（terminal redundancy)。所以，两个子代DNA分子中的单链末端可以互补，多余的单链部分被DNAase除去，然后再由DNA连接酶连接起来形成连环分子。,2、线性DNA复制的终止,（2）DNA的环化法 DNA进入宿主细胞内采用环化法，将线性分子连成环形。（3）真核细胞DNA末端复制依赖于端粒和能够识别或结合端粒的端粒酶。首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端粒酶（telomerase)，这种酶能将端粒结构中单链尾巴5 TTGGGG 3延

16、长，延长部分仍是 5 TTGGGG 3。各种端粒这种富含G的序列总是突出1216个核苷酸。,端粒酶：,端粒酶是一种核蛋白，由RNA和蛋白质构成。1990年，Blackburn等人证明了端粒酶中的RNA是富含G序列的模板。例如：游仆虫的端粒酶RNA含有5 CAAAACCCCAAAACC3 端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分子中。端粒酶中的RNA可能还有别的作用。由端粒酶连上的富含G的尾巴弯起来，作为引物复制以填补5 空缺。,四、不需要RNA引物的DNA复制,有些病毒的基因组是线性DNA，在原核细胞和真核细胞中复制时不需要RNA引物。如：腺病毒DNA和枯草菌噬菌体29DNA复制从DNA的一

17、端开始，而且对两端无选择性，各占50%的机率。这些DNA复制时，从一端开始，只能利用一条DNA链作为模板，即以35链为模板。这样，新合成的DNA链便将原来的亲代DNA链取代。原来的亲代DNA链(从合成起始端看是53链)作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的5和3可以互补配对，然后在3端开始以此链为模板重新合成另一条子链。,第三节RNA的合成,一、RNA合成的基本特征：1、RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP。2、RNA链的生长方向是5 3，核苷三磷酸加在新生链的3端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合方向转移。,一、R

18、NA合成的基本特征：,3、转录必须以一条DNA链为模板，按照碱基配对原则进行转录，因此DNA中的A、G、C、T将分别转录成U、C、G、A。在一个转录区内，一般只有一条DNA链可以转录。4、RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸，而且将在RNA链的5末端保持这一三磷酸基团。,二、RNA聚合酶,（一）原核生物RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶全酶为2全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应为椭圆球形。亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基脱离全酶后，剩下的2称为核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。亚基的功能可能是识别其相应的启动子。,E.coli RNA聚合酶

19、的亚基和转录因子,RNA聚合酶可能的结构：,（二）真核生物RNA聚合酶,有三类：RNA聚合酶，存在于核仁，合成5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA。聚合酶，存在于核质，合成hnRNA（mRNA的前体）和snRNA。聚合酶，存在于核质，合成tRNA和5S rRNA以及转录Alu顺序。,三、启动子,（一）原核生物的启动子对100个启动子在转录上游10和35 处有两个共同顺序。Pribnow框：TATAAT六核苷酸序列称之。位于10区，是RNA聚合酶牢固结合位点，简称结合位点。Sextama框：TTGACA六核苷酸序列称之。位于35区，是RNA聚合酶初始结合位点，RNA聚合酶依靠亚

20、基识别该位点，又叫RNA聚合酶识别位点,Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG,fdG2 CTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA,PL GGCGGGTGTTGACATAAATACCACTTGGCGGTGATACTGAGCACATCA,PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTA,tRNATyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTT,Sextama框,pribnow

21、,+1,T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96,17bp,（二）真核生物的启动子,比较了100个启动子，发现真核生物启动子是多部位结构（multipatide)主要有四个部位。1、帽子位点（cap site)：即转录起始位点。其碱基大多数是A（非模板链）两侧各有若干个嘧啶核苷酸。A为转录起点。2、TATA框：又称为Hogness框。位于25区附近其一致序列为：T82A97T93A85A63A83A50，基本上都是由A-T组成。在TATA框两侧有富含G-C碱基对的序列，这是TATA框发挥重要作用的因素之一。,（二）真核生物的启动子,3、CAAT框：一般位于75区

22、附近。一致序列为：GGCCAATCT，其头两个G的重要性并不亚于CAAT部分。作用：CAAT框控制着转录的频率。4、增强子：一般在100区以上。单位置较灵活，也可以位于下游或基因内部。作用：对转录有增强效用,四、转录过程,转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别 转录起始 通过启动子 转录的延伸和终止。,四、转录过程,（一）RNA合成的起始和延伸1、二元复合物的形成（只有全酶和DNA）（1）封闭的启动子复合物（2）开放性启动子复合物2、三元复合物的形成（全酶DNARNA）,RNA合成起始,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,RNA合成的延伸,由于基因转录所引

23、起的DNA超螺旋结构变化,（二）RNA合成的终止,转录终止信号存在于已转录的序列中。这种提供终止信号的序列称为终止子（terminator)。终止子有两类：（1）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终止作用，这种蛋白子因子称为释放因子，通常又称为 因子。（2）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终止作用。,1、不依赖 因子的终止子的特点：,（1）在终止点前有一段反向重复序列（2）方向重复序列中富含G-C碱基对（3）在反向重复序列下游有68个A-T对,2、依赖 的终止子的特点：,（1）在终止点前有一段反向重复序列（2）方向重复序列中G-C含量较少（3）方向重复序列下游的序列没有固定特征，其A-T含量较前者低。,

24、终止子终止转录的机制：,1、不依赖 因子：（1）富含G-C对之后810碱基处，转录会出现跌宕。（2）反向重复序列形成发夹结构之后，阻碍了RNA链从三元复合物中释放出来，使延宕时间延长。（3）一连串A转录出一连串U2、依赖 因子：（1）G-C含量低，（2）发夹结构缺乏U，所以只有 因子可终止转录。,五、转录后加工,（一）转录产物的修饰1、帽子2、多聚（A）尾巴,真核生物mRNA的帽子结构,（二）转录产物的剪接,1、rRNA的剪接（1）E.coli的三种rRNA：5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA与tRNA基因混杂，需要剪切。（2）真核生物rRNA人rRNA转录初产物为45S，经过剪切成

25、为18SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA。,2、tRNA的剪接（1）E.coli tRNA转录单位是多基因的需要剪切（2）真核生物酵母约400个核tRNA基因，有约40个基因中含有内含子，内含子长1446bp。需要切除内含子。3、hnRNA切除内含子内含子5 3 的拼接点序列为：GUAG。snRNA参与了识别拼接点的作用。,真核生物hnRNA内含子剪切示意图,第四节 蛋白质的合成,蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。,遗传密码三联子所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定

26、的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这3个核苷酸就是一个密码子。翻译从起始密码子AUG开始，沿mRNA 53 方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链蛋白质。,Crick关于tRNA分子破译mRNA遗传密码三联子的原始构想,三联子密码及其破译因为mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码（二联子），它们能代表的氨基酸也只有42=16种。若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。,用核苷酸的插入或删除实验证

27、明mRNA模板上每三个核苷酸组成一个密码子,遗传密码的性质1.密码的简并性 4种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其中61个是编码氨基酸的密码子，另外3个即UAA、UGA和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。,通用遗传密码及相应的氨基酸,C亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）组氨酸（His，H）精氨酸（Arg，R）U亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）组氨酸（His，H）精氨酸（Arg，R）C亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（Arg，R）A亮氨酸（Leu，L）脯氨

28、酸（Pro，P）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（Arg，R）G,A异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（Thr，T）天冬酰胺（Asn，N）丝氨酸（Ser，S）U异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（Thr，T）天冬酰胺（Asn，N）丝氨酸（Ser，S）C异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）A甲硫氨酸（Met，M）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）G,G缬氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（Gly，G）U缬氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（Gly，G）C缬氨酸（Val，V）丙氨

29、酸（Ala，A）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（Gly，G）A缬氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（Gly，G）G,除色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子。9种氨基酸有2个密码子，1种氨基酸有3个密码子，5种氨基酸有4个密码子，3种氨基酸有6个密码子。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。AUG和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子。,密码子的兼并性,3.密码子与反密码子的相互作用tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的

30、反向配对与mRNA上的密码子相互作用的。1966年，Crick提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分（如I）的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题。,mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子配对示意图。a.密码子与tRNA反密码子臂上相应序列配对；b.当反密码子第一位是I时，密码子第三位可以是A、U或C。,tRNAtRNA不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体，所以，它又被称为第二遗传密码。不同tRNA在结构上存在大量的共性，由小片段碱基互补配对形成三叶草形分子结构，有4条根据结构或已

31、知功能命名的手臂。最常见tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为2.5104，不同的tRNA分子可有7495个核苷酸不等。,D臂中存在多至3个可变核苷酸位点，17：1及20：1、20：2。最常见的D臂缺失这3个核苷酸，而最小的D臂中第17位核苷酸也缺失了。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。受体臂（acceptor arm）由链两端序列配对形成的杆状结构和3端未配对的34个碱基所组成，其3端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3或2自由羟基（OH）可以被氨酰化。TC臂是根据3个核苷酸命名的，其中表示拟尿嘧啶；反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名

32、的；,酵母tRNAphe的三级结构示意图（根据X-射线衍射数据绘制）。a和b表示用不同方法构建的模型。,tRNA的功能只有tRNA上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配对，而氨基酸本身不能识别密码子，只有结合到tRNA上生成AA-tRNA，才能被带到mRNA-核糖体复合物上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。用14C标记的半胱氨酸与tRNACys结合后生成14C-半胱氨酸-tRNACys，经Ni催化可生成14C-Ala-tRNACys，再把14C-Ala-tRNACys加入到蛋白质合成系统中，发现14C-Ala-tRNACys插入了血红蛋白分子中通常由半胱氨酸占据的位置上，表明起识别

33、作用的是tRNA。,AA-tRNA合成酶AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi 它实际上包括两步反应：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E）E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基转移到tRNA 3 末端腺苷残基的2 或3-羟基上。E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMP,核糖体核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）所组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20 000个核糖体，而真核细胞内可达106个。这些颗粒既可以游离状态

34、存在于细胞内，也可与内质网结合，形成微粒体。核糖体蛋白约占原核细胞总蛋白量的9-10%，占细胞内总RNA量的70-80%。在真核细胞内，核糖体所占的比重虽然有所下降，但仍然占总RNA的绝大部分，是细胞总蛋白的一个重要组成部分。,真核生物中，所有正在进行蛋白质合成的核糖体都不是在细胞质内自由漂浮，而是直接或间接与细胞骨架结构有关联或者与内质网膜结构相连的。细菌核糖体大都通过与mRNA相互作用，被固定在核基因组上。,结合在内质网上的核糖体。左，电镜下看到的胰腺细胞粗糙内质网；右，局部放大后的草图。,核糖体的结构核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的

35、rRNA和许多不同的蛋白质分子。原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。原核生物、真核生物细胞质及细胞器中的核糖体存在着很大差异。,几种不同生物核糖体及rRNA的组成,大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21表示，大亚基由36种蛋白质组成，分别用L1L36表示。真核生物细胞核糖体蛋白质中，大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质，它们的相对分子质量在81034.0104之间。,核糖体结构模型及原核与真核细胞核糖体大小亚基比较,真核生物细胞中发现的多聚核糖体现象,核糖体分子中可容纳两个tRNA和约40bp长的mRN

36、A。,核糖体的功能核糖体上至少有5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心）。此外，还应有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。,蛋白质合成的生物学机制核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，转移RNA是模板与氨基酸之间的接合体。蛋白质合成是一个需能反应。真核生物中可能有近300种生物大分子参与蛋

37、白质的生物合成，这些组分约占细胞干重的35%。细胞用来进行合成代谢总能量的90%消耗在蛋白质合成过程中。大肠杆菌只需要5-6秒钟就能合成一条由100个氨基酸组成的多肽。蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、延伸、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。,蛋白质合成各阶段的主要成分简表,氨基酸的活化蛋白质合成的起始是指在模板mRNA编码区5端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA

38、结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。起始复合物的生成除了GTP外，还需要Mg2+、NH4+及3个起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。,翻译的起始 翻译起始复合物的形成第一步，30S小亚基与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板相结合。第二步，fMet-tRNAfMet在IF-2的协同下进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA、mRNA、三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，释放翻译起始因子。,真核生物翻译起始复合物的形成,肽链的延伸生成起始复合物，第一个氨基酸（

39、fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸中的每个循环都包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位三步。,多肽链上肽键的形成缩合反应,1后续AA-tRNA与核糖体结合,细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰-tRNA首先与EF-Tu GTP形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮循环。由于EF-Tu只能与fMet-tRNA以外的其他AA-tRNA起反应，所以起始tRNA不会被结合到A位

40、上，mRNA内部的AUG不会被起始tRNA读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸。,2肽键的生成 细菌中肽链延伸的第二步反应：肽键的生成。,在核糖体mRNAAA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位。在肽基转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。,3.移位 肽键延伸的最后一步是移位，即核糖体向mRNA 3端方向移动一个密码子。细菌中肽链延伸的第三步反应：移位。核糖

41、体通过EF-G介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3末端移动一个密码子，使二肽基-tRNA完全进入P位,准备开始新一轮肽链延伸。,肽链的终止当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键，释放新生的肽链和tRNA，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。细菌细胞内存在三种终止因子（或称释放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止密码相结合，它们

42、就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF3可能与核糖体的解体有关。真核细胞只有一个（RF）终止因子。,蛋白质前体的加工1、N端fMet或Met的切除 无论原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕前就被切除。50%的真核蛋白中，成熟蛋白N端残基会被N-乙基化。2、二硫键的形成 mRNA中没有胱氨酸密码子，而不少蛋白质都含有二硫键。蛋白质合成后往往通过两个半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸。,3、特定氨基酸的修饰 氨基酸侧链的修饰作用包括磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）、乙基化（如组蛋白）、羟基化（如胶原蛋白）和羧

43、基化等。,生物体内最常见的被修饰的氨基酸及其修饰产物。,糖蛋白主要是蛋白质侧链上的天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基加上糖基形成的，胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸多数是羟基化的。实验证明，内质网可能是蛋白质N-糖基化的主要场所。,4、切除新生肽链中非功能片段如新合成的胰岛素前体是前胰岛素原，必须先切去信号肽变成胰岛素原，再切去C-肽，才变成有活性的胰岛素。脊髓灰质炎病毒的mRNA可翻译成很长的多肽链，含多种病毒蛋白，经蛋白酶在特定位置上水解后得到几个有功能的蛋白质分子。不少多肽类激素和酶的前体如血纤维蛋白原、胰蛋白酶原都要经过加工才能变为活性分子。,新生蛋白质经蛋白酶切割后变成有功能的成熟蛋白质。左：新

44、生蛋白质在去掉N端一部分残基后变成有功能的蛋白质；右：某些病毒或细菌可合成无活性的多聚蛋白质，经蛋白酶切割后成为有功能成熟蛋白。,前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图。,蛋白质的降解蛋白质降解是一个有序的过程。在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。蛋白质的半衰期从30秒到许多天不等。大部分真核蛋白的半衰期为数小时至数天。成红细胞=110天。真核蛋白的降解依赖于一个只有76个氨基酸残基、其序列高度保守的泛蛋白（Ubiquitin）。细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛蛋白相连，并将该复合体运送到特定的蛋白降解体系中直到完全降解。,泛蛋白在E1、E2和E3的作用下与被降解蛋白相连接的过程。,蛋白质的半衰期与N-端氨基酸残基的关系,成熟蛋白N-端的第一个氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物）在蛋白的降解中有着举足轻重的影响。,当某个蛋白质的N端是 甲硫氨酸、苷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3分钟就被降解了。,END,