生物药物分析与检验 酶分析法分析课件.ppt

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1、酶,分,析,法,教学目的和要求,?,熟悉：,1,酶活力的测定方法,2,酶法分析的测定方法,?,了解：酶分析法的原理,概,述,?,1.,酶的概念,是生物体内产生并具有催化活,性的一类蛋白质，由于表现出特异的催化,功能，因此酶被称为生物催化剂。,?,2.,酶的应用,：在体外进行催化反应,?,用以制造某些产品,?,用以去除某些物质,?,用以识别某种化合物,属于“酶分析法”,?,用以测定某种物质,?,酶是由,活细胞,产生的具有,催化作用,的特殊物质，,又称,生物催化剂,。,?,除极个别,RNA,为催化自身反应的酶外，其余所,有的酶都是蛋白质。,?,生物体内,一切生化反应,都需要酶的催化才能进,行！,?

2、,性能远远超过人造催化剂。,?,产物（,product,，,P,）,?,底物（,substrate,，,S,）,酶,的,概,念,酶是特殊的催化剂,(1),生物大分子,(2),催化条件温和,(3),强酸、碱或高温下失活,(3),高选择性,(4),高催化效率,机理：降低反应活化能，提高反应速度，不改,变平衡点。,只起催化作用，本身不消耗。,酶,的,特,点,概,括,如,下,：,概,述,?,3.,酶分析法包括两种类型,：,?,一是以酶作为,分析对象,，这类分析方法称,为,“酶活力测定”,。,?,二是以酶作为,分析手段,，用以测定样品中,用一般化学方法难于检测的物质，通常将,这类分析方法称为,“酶法分析

3、”,；,4.,两类酶分析法的区别,?,相同：从原理到方法,?,不同：,酶活力测定法中,，是以酶为分析对象。,使用的,底物,应该,过量,。,?,酶法分析中,，是以酶为分析工具或分析试,剂,被检化合物（如：,底物,）,是反应的限,制因素,酶法分析的优点,1,用于复杂组分中结构或物理化学性质比,较相近的同类物质的分离鉴定和分析。,2,特异性强、干扰少、操作简单、样品和,试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等,特点。,3,通过了解酶对底物的特异性，可以预料,可能发生的干扰反应并设法纠正。,4,可用偶联反应。,5,无污染或污染很少的分析方法。,?,共同点：原理和方法相同，以酶,的专一高效催化某化学反应为基

4、,础，通过测定酶反应的速率或生,成物浓度来检测相应物质的含量。,第一节,酶活力测定法,?,一、基本概念,?,二、酶促反应的条件,?,三、酶活力的测定方法,?,四、测定过程中应注意的问题,一、基本概念,?,1.,酶活力,：指酶催化一定化学反应的能力。,?,2.,酶活力的测定：,是测定一个被酶所催化,的化学反应的速度。,?,3.,酶活力测定的目的：,通过酶反应速度的,测定，求得酶的浓度或含量,酶活力,(enzyme activity),的测定,?,酶活力,是指酶催化某一化学反应的能力，,?,酶活力的,大小,可以用在一定条件下所催化的某一,化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率,愈大，酶的活力愈

5、高；反应速率愈小，酶的活力,就愈低。两者呈线性关系。,?,所以,测定酶的活力就是测定酶促反应的速,率,。,?,酶催化的,反应速率,可用单位时间内底物的减少量或产,物的增加量来表示。,?,在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。,?,V,=,p,/,t,p,=,v,t,P,0,X,时,间,T,V,0,V,X,产,物,浓,度,引起酶促反应速率降低的原因,?,(1),底物浓度的降低；,?,(2),产物浓度增加加速了逆反应的进行；,?,(3),产物对酶的抑制或激活作用,?,(4),随着时间的延长引起酶本身部分分子失活,等。,?,因此,测定酶活力，应测定酶促反应的初速率,，,反应初速率与酶量呈线性关

6、系，因此可以用,初速率来测定制剂中酶的含量。,检验酶反应和测定系统是否适宜的标准,?,测得的,反应速度,必须和,酶浓度,间有,线,性的比例关系,一、基本概念,?,4.,酶反应的速度：,用单位时间内反应底物,的减少或产物的增加来表示，酶反应的速,度愈快所表示的酶活力愈高。,?,5.,测定酶活力的方法,：可用物理法、化学,法或酶分析法等方法。,一、基本概念,?,6.,常用的酶分析法,?,第一，终点法,?,第二，取样测定法,?,第三，连续测定法,一、基本概念,?,7.,酶的活性单位（国际单位,U,）,：在,25,及最,适条件下，每分钟能转化一个微摩尔,(mol),底,物的酶量定为一个活性单位。,?,

7、8.,酶的比活性：,为一毫克,(mg),酶的活性单位数,目。,国际酶活力单位,?,1961,年,国际生物化学协会酶学委员会提,出采用统一的“国际单位”,(U),来表示酶,活力，,规定,为：在最适反应条件,(,温度,25)下，每分钟内催化,1,微摩尔,(umo1),底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶,活力单位，即,?,1 U=1 umol,min,。,酶的比活力,(specific activity),?,比活力,:,每,mg,蛋白质所含的酶活力单位,数表示，,?,比活力,=,活力,U,mg,蛋白,=,总活力,U/,总蛋,白,mg,?,有时用每,g,酶制剂或每,m1,酶制剂含有多,少个活力单位

8、来表示,(U,g,或,U,ml),。,?,比活力大小的含义：,可用来比较每单位,质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，,表示酶的纯度愈高。,活力单位,(U),与比活力,?,U,速度单位,?,每小时催化,1,克底物,?,每小时催化,1,ml,某浓度溶液,?,每分钟催化,1ug,底物,?,酶产品质量评价中常使用比活力,?,单位质量,酶产品中酶活力称,比活力。,?,u/mg,酶蛋白,u/ml,酶蛋白,?,国际单位（,IU,）：在实验规定的条件下（25，,最适,pH,、最适底物浓度时），,1ul,标本，以每,分钟能催化,1,微摩尔底物的酶量为,1,个国际单位。,酶促反应速度的测定方法,P,0,X,时,间,

9、T,V,0,V,X,产,物,浓,度,产物浓度变化曲线,提问：,为什么反应速度会随,时间减小？,答案：,1.S,降低；,2.,酶受到产物抑制,提问：,用哪一个速度来表示,该酶促反应的速度特征呢？,反应初速度,V,o,反应,初,速度表示酶活力。,提问：,仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？,答案,：,不行，,还与酶的加入量及条件有关。,酶活力测定实例,?,首先,确定反应条件,20,、,pH=7,，底物浓度,6g/l,（过,量），加入,2mg,固体脂肪酶,?,第二,确定活力单位,如每小时催化,1,克底物,1u=1g/h,?,第三,测算反应初速度,作产物甘油随时间增加的曲线，,量出反应初速度值,，换算为

10、脂肪的消耗速度,如,8g/h,?,第四,换算活力,8g/h,/,1g/h=8,u,?,第五,计算比活,8,u,/2,mg,酶蛋白,=4,u,/,mg,酶蛋白,脂肪,脂肪酶,甘油,+,脂肪酸,二、酶促反应的条件,?,基本要求,：,?,反应系统中除了,待测酶的浓度,是影响速度,的,惟一因素,外，其他因素都处于最适于酶,发挥催化作用的水平。,确定反应条件时应考虑：,（,1,）,底物,选用的底物在物理化学性质上,和产物不同,。,一般选用底物的浓度,S=100 Km,一般选择,Km,小的作测定的底物。,?,（,2,）,pH,值,注意选择适宜的反应,pH,值，,并将反应维持在这一,pH,值。,?,例：丙酮

11、酸,乳酸,乳酸脱氢酶,pH,对酶反应的影响,pH,影响酶活力的原因,?,(1),过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，,引起酶构象的改变，酶活性丧失。,?,(2),当,pH,改变不很剧烈时，酶虽未变性，但,活力受到影响。,?,影响了,底物,的解离状态；,?,影响,酶分子,活性部位上有关基团的解离；,?,影响到,中间络合物,ES,的解离状态，不利于催,化生成产物。,二、酶促反应的条件,（,3,）,温度,实验中温度变动应控制在,0.1,以内。酶反应的温度通常选用,25,、,30,、,37,。,（,4,）,辅助因子,为了提高酶在反应系统中,的稳定性，有些也需要某些相应的物质。,最适温度,机理：,温度导,

12、致酶蛋,白变性,温度对酶反应的影响,温度对酶反应的影响,?,在最适温度之前，一般温度越高，反应速,度就越快。,?,酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力,要高。通常酶制剂以固体保存为佳。,（,5,）,空白和对照,空白,指杂质反应和自发反应引起的变化量，,提,供未知因素的影响,对照,作为比较或标定的,标准,。,三、酶活力的测定方法,?,按取样及检测的方式,?,（一）取样测定法,?,（二）连续测定法,（一）取样测定法,?,1.,取样测定法：,求得单位时间内酶促,反应变化量的方法。,?,2.,常用的检测方法,：紫外,-,可见分光,光度法、荧光分析法等。,取样测定法,在酶反应开始后不同的时间，从反应系统

13、,中取出一定量的反应液，并用适当的方法,（添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反,应后，再根据产物和底物在化学性质上的,差别，选用适当的检测方法进行定量分析，,求得单位时间内酶促反应变化量的方法。,取样测定法,取样测定法一直沿袭至今是因为：,?,不需要特殊仪器,?,几乎所有酶反应都可根据产物或底,物的化学性质找出具体的测定方法,?,由于色源底物和荧光源底物的发展，,可在原来的底物分子上接上相应的,有色基团、发色基团或荧光基团。,?,3,、终止酶反应：,添加酶的变性剂,?,三氯醋酸：紫外光区有吸收,?,高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用,?,4,、特点：,?,不需要特殊仪器,?,容易找到具体测定方

14、法,?,色源底物和荧光源底物发展快,（二）连续测定法,?,1.,连续测定法,：基于底物和产物在,物理化,学性质上的不同,，在反应过程中对反应系,统进行直接连续检测的方法。,?,2.,常用的检测方法,连续测定法,?,基于底物和产物在物理化学性质,上的不同，在反应过程中对反应,系统进行连续检测的方法。,连续测定法的准确性和测定效率,比较好,酶活不能反映酶的使用效果,只能用于产品质量的控制,测定过程中应注意的问题,?,产物的测定,?,反应速度的测定,?,测定要达到的要求,酶反应进程曲线,0,1,2,3,4,5,6,0,5,10,15,20,t/min,c,/,m,g,/,m,L,50,40,30,2

15、0,10,酶量,生化药物制剂检验程序,生化药物制剂检验程序,酶浓度曲线的关系,0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0,10,20,30,40,50,60,酶量,反,应,速,率,t=15,t=10,t=5,t/min,酶分析法的检测方法,?,最常用的方法介绍如下：,?,(1),紫外,-,可见分光光度法,?,(2),荧光分析法,?,(3),旋光度法,?,(4),酶偶联测定法,?,(5),其他检测法,酶分析法的检测方法,一、紫外,-,可见分光光度法,?,NAD,+,(,烟酰胺,-,腺嘌呤二核苷酸，又称为辅,酶,I),和,NADP,+,(,烟酰胺,-,腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶,I

16、I,),是维生素烟酰胺的衍生物，,O,CH,2,OPOPOCH,2,OH,OH,O,O,O,-,O,-,N,+,CONH,2,O,OH,OH(OPO,3,H,2,),N,N,NH,2,N,N,N,NH,2,O,R,NH,2,O,R,N,C,+,C,还原,氧化,NAD,+,NADH,在,338.5nm,与,340.5nm,之,间有一个最大吸收峰,300-400nm,无吸收,丙酮酸,+NADH+H,+,LDH,乳酸,+NAD,+,例,1,、,例,2,、,天冬氨酸,+,a,-,草酰酮戊二酸,谷氨酸,+,草酰乙酸,GOT,草酰乙酸,+NADH+H,苹果酸,+NAD,+,MDH,酶偶联测定法,：是应用过

17、量、高度专一的,“偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可,直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。,被测反应,G+ATP,G-6-P+ADP,HK,G-6-P+NADP,NADPH+6-P-GCOOH,G6PDH,偶联指示反应,被测反应,AMP+ATP,2ADP,肌激酶,辅助反应,ADP+PEP,ATP+Pyr,丙酮酸激酶,指示反应,Pyr+NADH+H,+,L+NAD,+,乳酸脱氢酶,二、荧光分析法,三,华勃氏呼吸仪检压法,四、放射性同位素测定法,华,勃,氏,微,量,呼,吸,仪,（,瓦,氏,呼,吸,仪,）,五,电化学法（,electrochemical,）,?,pH,测定法：,用高灵敏度的

18、,pH,计，跟踪反,应过程中,H+,变化的情况，用,pH,的变化来,测定酶的反应速率。,?,离子选择电极法：,测定某些酶的酶活力，,用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应，,如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很,方便地测定。,第二节,酶法分析,?,一、终点测定法,?,二、反应速度法,一、原理,是在以待测物质为底物的酶反应中，如果,能使底物能够接近完全地转化为产物，而,且底物或产物又具有某种特征性质，通过,直接测定转化前后底物的减少量，产物的,增加量或辅酶的变化就可以定量待测物,平衡法,?,用于复杂组分中结构或物理化学性质比较,相近的同类物质的分离鉴定和分析。,?,特异性强、干扰少、操作简单、样品和试,

19、剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特,点。,?,通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能,发生的干扰反应并设法纠正。,?,可用偶联反应。,?,无污染或污染很少的分析方法。,优,点,：,一、终点测定法,?,1.,原理,：先借助酶反应（单独的反应或几种酶,构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转,变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅,酶物质（第二底物）等的变化量。,?,2.,一般采用的测定方法：,?,光吸收、荧光之类的分光光度法,?,测定气体产生与吸收的测压量气法（华勃氏,呼吸仪检压法）,?,检知,pH,值变化的滴定法,?,同位素跟踪测定法,（一）终点法条件,?,1,酶的底物特异性（专一性）,：

20、具有高度的,底物专一性，有一些酶是呈族特异性；,?,2,反应的平衡,：,?,酶反应若平衡十分偏向进行方向，则可方便地,用终点测定法检测；,?,但若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或者,偏向逆方向，此时由于反应不能完全，因而反,应就不能正确定量，解决这一问题，通常可采,取一些措施。,反应的平衡,谷氨酸,+,NAD,+,+H,2,O,a-,酮戊二酸,+NADH+NH,+,谷氨酸脱氢酶,NADH+,丙酮酸,乳酸,+NAD,+,乳酸脱氢酶,?,3,反应液中的酶量,：要使酶反应在短时间内,完成，只有使用对底物亲和性很大的酶（即,Km,要小），酶用量（即,Vmax,）必须大才能达到此,点。工作中，在,10

21、min,内反应完成,99%,，则常,数,K,以,1.0min-1,为宜。,?,4,反应产物抑制：,如果产物对反应本身有抑,制作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可,将该产物除去或者和再生系统偶联等办法解决。,反应产物抑制,S+ATP,P+ADP,丙酮酸,丙酮酸激酶,磷酸烯醇式丙酮酸,S,激酶,（二）终点法种类,?,1,单酶反应定量法：,（,1,）,底物减少量的测定,：在以待测物质为,底物的酶反应中，如果底物能接近完全地,转化为产物，且又具有某种特征性质（例,如特征的吸收谱带）时，则就可能简便地,通过直接测定底物的减少量，而定量待测,物。,（二）终点法种类,（,2,）,产物增加量的测定,：在以被

22、测物为底,物的酶的反应中，如果底物基本上都能转,变为产物，而产物又具有可以专一地进行,定量测定的性质，那么根据产物增加就能,检知底物的量。,（,3,）,辅酶变化量的测定,：以,NAD,或,NADP,为辅酶的脱氢酶反应，通过测定,340nm,吸收度的变化，就能对作为相应脱氢酶底,物的物质进行定量分析。,1.,羟基丙酮酸的定量测定,羟基丙酮酸,+NADH+H,D,甘油酸,+NAD,+,L-,谷氨酸,+NAD,+,+H,2,O,甘油酸脱氢酶,2.L-,谷氨酸的定量测定,a,-,酮戊二酸,+NADH+NH,4,+,谷氨酸脱氢酶,?,2,和指示酶反应偶联的定量法,（,1,）,以脱氢酶为指示剂,：用来作为

23、偶联指,示剂的酶中应用得最广泛的是以,NAD,或,NADP,为辅酶的脱氢酶类,（,2,）,以脱氢酶以外的酶作指示剂,：参与某,些色素氧化还原的酶中有的可用作指示剂，,反应的进行可由吸收度的变化来测定。,2,、和指示酶反应偶联的定量法,以脱氢酶为指示剂,1-,磷酸,-,葡萄糖,6-,磷酸,-,葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶,1,，,6-,二磷酸葡萄糖,6-,磷酸,-,葡萄糖,+NADP,6-,磷酸,-,葡萄糖醛酸,+NADPH+H,+,6-,磷酸,-,葡萄糖脱氢酶,D-2-,磷酸甘油酸,磷酸烯醇丙酮酸,烯醇化酶,磷酸烯醇丙酮酸,+ADP,丙酮酸激酶,丙酮酸,+ATP,丙酮酸,+NADH+H,+,乳酸脱

24、氢酶,乳酸,+NAD,+,以脱氢酶以外的酶为指示剂,D-,葡萄糖的定量测定,葡萄糖,葡萄糖醛酸,+H,2,O,2,H,2,O,2,+4-,氨基安替比林酚,醌亚胶色素,+4H,2,O,葡萄糖氧化酶,过氧化物酶,二、反应速度法,反应速度法,是在一定条件下（一定,pH,值和,温度），测定反应的初速度，而反应的初,速度与被测物质的浓度成正比关系，因此,可根据初速度计算被测物质的量，也可利,用标准品对照法计算被测物质的量。,特,点,：,测定速度快,试剂用量少,成本低,对浊度和色素的干扰不敏感,不需要考虑反应是否进行完全,具体测定方法,?,（一）利用作底物的测定法,?,（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法

25、,?,（三）特殊的反应速度测定法,（一）利用作底物的测定法,?,在一定,pH,及温度下测反应初速度。反应,时除被测物（底物）外，其他影响反应速,度的物质均是过剩，,反应初速度则与被测,物的浓度成正比关系,。,甘油三酯,甘油,+,脂肪酸,甘油,+ATP,甘油,-1-,磷酸,+ADP,ADP+PEP,丙酮酸,+ATP,丙酮酸,+NADH+H,+,乳酸,+NAD+H,2,O,脂肪酶,GK,PK,LDH,（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法,?,如被测物质可作为某种酶专一的辅酶,（或抑制剂），则这种物质的浓度和将其,作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速度之,间有关联，因此通过测定该酶的反应速度,就能进行这

26、种物质的定量。,D-2,，,3-,二磷酸甘油酸的定量测定,D-3-,二磷酸甘油酸,D-2-,二磷酸甘油酸,磷酸甘油酸变位酶,D-2,，,3-,二磷酸甘油酸,（三）特殊的反应速度测定法,?,如果将待测物质相关的两种酶反应偶联起,来，构成待测物质能够再生的循环系统，,然后再将可作指示剂的第三种酶反应在适,当的条件下与之偶联，那么指示剂酶反应,的速度应该和待测物质量之间有一定的比,例关系。,乙酰磷酸,+CoA-SH,乙酰,CoA+,磷酸,PTA,柠檬酸,+,CoA-SH,草酰乙酸,+,乙酰,CoA+H,2,O,CS,苹果酸,+NAD,+,NADH+,草酰乙酸,+H,+,MDH,作,业,1,、什么是酶法分析？与酶活力测定有何异,同？,2,、酶的活性单位（国际单位）是什么？,3,、酶活力的测定方法有几种,?,4,、简述酶法分析中的终点测定法与反应速,度法。,