第六章 免疫标记技术ppt课件.pptx
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1、免疫标记技术,经典免疫学技术,沉淀反应凝集反应补体参与的抗原抗体反应中和反应,沉淀反应,凝集反应,补体参与的抗原抗体反应,中和反应,经典免疫学技术的不足,灵敏度周期长可重复性无法定量无法定位特异性差,关键问题,免疫标记技术(immunolabelling technique),用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。,免疫标记技术,分类:免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点:高度灵敏、特异、快速,定性、定量、定位,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光
2、技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术,一、放射免疫技术 二、免疫放射技术,第一节放射免疫技术,一、放射免疫技术 二、免疫放射技术,第一节放射免疫技术,(一)放射免疫技术的原理(二)放射免疫技术的基本条件(三)放射免疫技术的基本类型,一、放射免疫技术,(一)放射免疫技术的原理(二)放射免疫技术的基本条件(三)放射免疫技术的基本类型,一、放射免疫技术,放射免疫技术(radioimmunoassay,RIA),(1977年获诺贝尔生理和医学奖),放射免疫技术的原理,RIA是以放射性同位
3、素标记抗原的一种竞争性免疫抑制试验,(一)放射免疫技术的原理(二)放射免疫技术的基本条件(三)放射免疫技术的基本类型,一、放射免疫技术,(二)放射免疫技术的基本条件,1抗原标准品与待测抗原 2放射性同位素 3特异性抗体 4常用的同位素标记方法5B与F的分离技术,1抗原标准品与待测抗原,标准品是放免技术的定量依据 标准品:与待测样品的化学结构完全相同 替代品:与待测样品的结构相似,但要与抗体的亲和力相近,应列出与真标准品的换算系数。,2.放射性同位素,3.特异性抗体,放射免疫技术的抗体应具备:特异性高、亲和力高(平衡常数K值大)、效价高,(即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合,极少解离,保证检测
4、的灵敏度),4.常用的同位素标记方法,氯胺T氧化标记法 乳过氧化物酶标记法 半抗原标记法,5.B与F的分离技术,(1)双抗体沉淀分离法(2)化学试剂分段沉淀分离法(3)固相法(4)吸附法,结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。,分离剂的要求,能使B和F完全分离 不受外界因素的干扰 与游离抗原的非特异性作用尽可能小 操作简便、分离迅速、重复性好 来源广,经济,便于使用,(1)双抗体沉淀分离法,优点:本法操作简便、稳定缺点:易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰,使非特异性吸附有较大变异,且第二抗体消耗量大。,加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大,从而使
5、原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。,(2)化学试剂分段沉淀分离法,利用盐类或有机化合物使反应液中的-球蛋白在等电点沉淀,从而达到分离的目的。如:聚乙二醇(PEG)、硫酸铵等,优点:试剂来源广泛、价格便宜缺点:影响因素多(温度、pH值、浓度等),(3)固相法,将测定用的第一抗体(或第二抗体)牢固地结合于固相载体表面,相应抗原(或第一抗体)经温育被吸附,只要将固相表面洗涤即将B和F分离。优点:操作简便、快速 新的固相分离方法:纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法,(4)吸附法,本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。,如:活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等性质:对
6、蛋白质、多肽、药物等具有非特异性 吸附的能力应用:在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时,将会限制大分子物质的吸附。沉 淀 中:吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中:抗原抗体复合物,优点:操作简便、分离迅速缺点:专一性不强,(一)放射免疫技术的原理(二)放射免疫技术的基本条件(三)放射免疫技术的基本类型,一、放射免疫技术,(三)放射免疫技术的基本类型,1液相法(1)平衡法(又称一步法)(2)顺序加样法2固相法(1)竞争法 Ag+Ag*+Ab-(2)改良法 Ag+Ag*+Ab+AntiAb-,一、放射免疫技术 二、免疫放射技术,第一节放射免疫技术,(一)免疫放射技术的原理(二)免疫放射技术的基
7、本条件(三)免疫放射技术的基本类型,二、免疫放射技术,(一)免疫放射技术的原理(二)免疫放射技术的基本条件(三)免疫放射技术的基本类型,二、免疫放射技术,1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术(immunoradiometric assay,IRMA)标记抗体作示踪剂,在反应系统中加入过量的抗体,待测物(或标准品)和同位素标记抗体全量反应。优点:灵敏度高(可提高6-10倍)、准确度高、重复性好、检样量少缺点:干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染,免疫放射技术(immunoradiometric assay,IRMA),(一)免疫放射技术的原理(二)免疫放射技术的基本条件(三)免
8、疫放射技术的基本类型,二、免疫放射技术,(二)免疫放射技术的基本条件,1标记抗体的制备 2固相抗原免疫吸附剂,(一)免疫放射技术的原理(二)免疫放射技术的基本条件(三)免疫放射技术的基本类型,二、免疫放射技术,(三)放射免疫技术的基本类型,1.经典IRMA法2.双抗体夹心法二抗标记法双标记抗体法,1.经典IRMA法,2.双抗体夹心法,标记,3.二抗标记法,4.双标记抗体法,双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体(Ab2、Ab3)标记上不同的同位素,可以用不同的检测仪进行测定。,放射分析技术方法学考核指标,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他
9、免疫标记技术,一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术,第二节免疫荧光技术,一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术,第二节免疫荧光技术,Albert Hewett Coons(19121978),20世纪40年代Coons等首先用荧光素FITC标记抗体,成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原,从而创建免疫荧光技术(immuno-fluorescence technique)。,一、免疫荧光技术的原理,三结合:抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性 优点:特
10、异性强、敏感性高、速度快,结果直观,可以检测和定位微量抗原 缺点:荧光易发生淬灭,荧光染色标本保存困难、易出现非特异性染色问题,镜检结果判定客观性不足,一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术,第二节免疫荧光技术,1.荧光素 2.荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,1.荧光素 2.荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,1荧光素,荧光素:可以产生明亮荧光的染色物质,荧光素的性质,吸收光后电子跃迁 保持固有的荧光特性 荧光的波长总是大于激发光波长(STOKES 法则)荧光强度小于激发光的强度,荧光效率=发射
11、光量子数/吸收光量子数100%荧光强度=吸收光量子数荧光效率,荧光的种类,自发荧光,二次荧光,非特异性荧光:自发荧光 诱发荧光 酶诱发荧光,荧光素选择条件,荧光强度高且稳定 能轻易与蛋白质分子形成稳定共价键 荧光素与蛋白质结合的方法应简便、快速 产生的荧光颜色应与自发荧光对比鲜明 结合物在一般贮存条件下性能稳定,可保存较长时间,荧光素,1.荧光素 2.荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,荧光标记抗体的制备,(1)搅拌标记法(Marshall法)(2)半透膜透析标记法(Clark法),荧光标记抗体的纯化,(1)去除游离荧光素(2)去除未标记和过度标记的抗体,荧光标记抗体的鉴
12、定,(1)抗体与荧光的活性鉴定(2)荧光素与蛋白质的摩尔比值(F/P)采用紫外分光比色法测定FITC(F)OD值和 蛋白质(P)OD值以后,用以下公式计算F/P比值:F/P比值=(2.87OD495)/(OD2800.35OD495)(3)荧光抗体浓度的测定(4)荧光抗体特异性的鉴定:特异性吸收试验,竞争抑制试验,1.荧光素 2.荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,3.荧光检测仪,(1)荧光显微镜(2)荧光分光光度计,(1)荧光显微镜,透射式,落射式,透射荧光显微镜原理,低倍镜较明亮,高倍镜较暗,在油浸和调中时,较难操作,尤以低倍的照明范围难于确定,但能得到很暗的视野背景
13、。透射式不适用于非透明的被检物体。,落射式荧光显微镜,激发滤光板,位于聚光镜和光源之间,可滤过由荧光灯源发射出的其他光,只允许波长为275480nm的紫外光(MG)和蓝紫光(BG)通过,以激发荧光结合物发射荧光。,汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G),激发滤色镜:波长选择,分色镜:反射激发光,透过荧光,吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光,落射荧光显微镜原理,对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用,不仅便于操作,而且从低倍到高倍,可以实现整个视场的均匀照明。,(2)荧光分光光度计,用于扫描荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、
14、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。,一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术,第二节免疫荧光技术,1.直接荧光抗体染色法 2.间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法特殊染色法,三、经典荧光抗体染色法,1.直接荧光抗体染色法 2.间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法特殊染色法,三、经典荧光抗体染色法,1.直接荧光抗体染色法,优点:简单、快速、特异性高缺点:检测每种抗原需制备相应抗体、敏感性差,将荧光素标记在特异性抗体上,直接检测抗原,1.直接荧光抗体染色法 2.间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法特殊染色法,三、经典
15、荧光抗体染色法,2.间接荧光抗体染色法,优点:敏感性高、一种二抗可检测多种抗原抗体系统缺点:干扰因素多、操作流程长,将荧光素标记在第二抗体(抗抗体)上或标记在SPA上,检测与抗原结合的特异性抗体,肿瘤组织中M2型巨噬细胞,1.直接荧光抗体染色法 2.间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法特殊染色法,三、经典荧光抗体染色法,3.补体荧光染色法,优点:可检测所有抗原抗体系统,具有通用性;敏感性高缺点:操作过程较复杂,干扰因素多,易出现非特异性染色,补体易失活,将荧光素标记在补体的抗体上(抗C3抗体),检测抗原抗体复合物。,1.直接荧光抗体染色法 2.间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法特殊染色法,三、经
16、典荧光抗体染色法,4特殊染色法,(1)双标记免疫荧光技术(2)双色免疫荧光技术(3)反衬染色法,(1)双标记免疫荧光技术,在同一标本中,可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色,同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。如:FITC(黄绿色荧光)标记Ab1 RB200或TRITC9(桔红色荧光)标记Ab2,细胞内双标记荧光染色,DAPI+FITC,FITC+PI,(2)双色免疫荧光技术,如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI(红色)DAPI(蓝色),(3)反衬染色法,是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如:用RB200标记BSA作为非特异性反衬标记,用FITC标记特异性抗体。
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