第六章 兽药残留检测技术苯并咪唑类ppt课件.ppt
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1、第六章 兽药残留检测技术,第七节 苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法,一、概述,苯并咪唑类(Benzimidazoles,BEN)是一种驱虫剂,被广泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。自20世纪60年代早期,美国合成噻苯达唑以来,已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑作为第一个商品化的苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。,由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大,且驱虫谱不广,目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物阿苯
2、达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。,苯并咪唑类药物的结构式,苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。,苯并咪唑环,苯并咪唑类药物,1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太尔(Febantel,FE
3、B)5、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)8、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)9、奥苯达唑(Oxibendazole,OXI)10、氟苯达唑(Flubendazole,FLU)11、三氯苯达唑(Triclabendazole,TCB),1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ),别名噻菌灵、特克多、涕必灵、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪,为白色至奶黄色粉末,无臭,味微苦,微溶于水或乙醇,易溶于稀盐酸或稀碱液中,不溶于氯仿或苯中。广谱驱虫药,可能是抑制虫体的延胡索酸还原酶。对动物多
4、种胃肠道线虫均有驱除效果,对成虫效果好,对未成熟虫体也有一定作用。内服吸收快,广泛分布于各组织中。猪、羊、牛给药后27h达血药峰浓度。在体内迅速代谢成5-羟噻苯达唑(5-OH-TBZ),犊牛用药后,肾中药物浓度最高,但肝的滞留期比肾长;噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在肝和肾中的残留量分别为57g/kg、581g/kg和153g/kg、19g/kg;休药6天只有肝中有5-羟噻苯达唑残留量(63g/kg);噻苯达唑在肌肉和脂肪中未被检出,但5-羟噻苯达唑在用药后1日内可检出,其残留量分别为肌肉54g/kg、脂肪64g/kg。奶牛用药后12h,噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在奶中的残留量分别为5007g/kg和
5、168g/kg,84h时分别为20g/kg和25g/kg。,2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM),别名噻苯达唑酯,为广谱驱虫药。对动物肠道寄生虫和肺蠕虫有明显作用。制剂有混悬剂、糊剂或饲料粉的形式。内服后在体内迅速代谢,原药和代谢物主要经胆汁排泄,尿中占给药量的25%,其中原形的不足5%。牛内服后30日内,肝中可检出残留物,其中一部分为结合态。坎苯达唑有致畸性,因此休药期要求适当的延长。牛休药期21天,羊休药期28天。,3、苯硫脲酯(Thiophanate),别名硫菌灵、硫苯尿酯,属苯并咪唑的前体药物,即在动物体内转变成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而发挥驱虫作用。本品为微黄棕色结晶性粉末,
6、在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶,在环己酮中易溶。动物制剂有混悬剂和丸剂两种,或用作饲料添加剂。广谱驱虫药,对大多数动物的胃肠线虫成虫及幼虫均有良好效果。内服吸收快而完全,8h达血药峰浓度。用药后24h,几乎能从所有组织器官中(特别是肝、肾)测出药物。用药后72h内,大部分药量经粪和尿排出体外。,畜禽用药后,残留量在肝和肾中较高,而其他可食组织中相对较低。绵羊一次内服100mg/kg后休药1日,肝、肾、肌肉和脂肪中的残留量分别为930g/kg、1060g/kg、670g/kg和2930g/kg;休药3日后均低于100g/kg。犊牛一次内服100mg/kg后休药7日,肝、肾和肌肉中的残留量均低于
7、200g/kg。猪一次内服75mg/kg后休药1日,肝、肾、肌肉和皮/脂肪中的平均残留量分别为5550g/kg、6600g/kg、2600g/kg和16200g/kg;休药3日分别为180g/kg、100g/kg、100g/kg和250g/kg;休药7日组织中残留均低于100g/kg。奶牛一次内服100mg/kg后休药6h、20h和30h,奶中残留量分别为440g/kg、320g/kg和140g/kg;休药44h奶中未检出残留量(方法检测限50g/kg)。,4、非班太尔(Febantel,FEB),别名苯硫氨酯,为无色粉末,在丙酮、氯仿、四氢呋喃和二氯甲烷中溶解,在水和乙醇中不溶。非班太尔(F
8、EB,属苯并咪唑类前体药物,内服后在胃肠道内迅速代谢为芬苯达唑(FBZ)及其砜类化合物(FBZ-SO和FBZ-SO2),FBZ-SO又称奥芬达唑(OFZ),原药在体内浓度很低。代谢物的驱虫活性比母药非班太尔要强得多,而发挥有效的驱虫效果。非班太尔在美国已批准用于各种动物的驱线虫药,以复方制剂上市,如用于犬、猫的产品多与吡喹酮等配合,以扩太驱虫范围。,牛内服后18h,肝中约占总残留量的90%,其中芬苯达唑30%41%,奥芬达唑4%19%,奥芬达唑砜14%15%,非班太尔3%6%,以及一些微量的氨基代谢物。休药10日,肝中残留量下降很多,其中以结合态的约占75%。鼠、羊、牛和猪内服后,组织中的残留
9、量依次为肝肾脂肪肌肉。,5、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ),别名硫苯达唑、苯硫达唑,无臭无味,在二甲基亚砜中溶解,在甲醇中微溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。为广谱、高效、低毒的新型苯并咪唑类驱虫药。它不仅对动物胃肠道线虫成虫、幼虫有高度驱虫活性,而且对网尾线虫、矛形双腔吸虫、片形吸虫和绦虫亦有较佳效果。芬苯达唑在国外,不仅用于各种动物,甚至还有野生动物的专用制剂。由于芬苯达唑溶解度较低,因而给动物内服时吸收极少,如给绵羊、牛、猪内服因吸收少,经粪便排泄的原形药约占44%50%,而经尿排泄的不足1%。,吸收后芬苯达唑在动物体内迅速代谢为芬苯达唑亚砜(FBZ-SO)即奥芬达唑(OFZ
10、)、芬苯达唑砜(FBZ-SO2)、芬苯达唑-2-氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代谢物。原药和代谢物主要经胆汁排泄。在绵羊体内的代谢产物,由胆汁分泌后可再经肝肠循环。猪用药5mg/kg后休药7天,肝中母药残留量为0.28mg/kg,其他无组织残留。,牛用药10mg/kg后休药2天,肝、肾、肌肉和脂肪中的母药残留量分别为8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和0.95mg/kg;休药7天,只在肝中能检测到残留量0.67mg/kg。奶牛内服10mg/kg后,1224h奶中芬苯达唑浓度达峰值,休药7天降至100g/kg;12h芬苯达唑亚砜浓度达峰值,然后迅速下降,96
11、h时未检出;48h芬苯达唑砜浓度达峰值,96h时未检出。鳟鱼内服后,在体内部分代谢为奥芬达唑,并蓄积于鱼皮中。母药和奥芬达唑的消除期分别为96h和24h。芬苯达唑砜代谢物在鱼体内几乎没有。,6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ),别名磺唑氨酯,为白色或类白色粉末,有轻微的特殊气味,在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。奥芬达唑为芬苯达唑的衍生物,属广谱、高效、低毒的新型抗蠕虫药,其驱虫谱大致与芬苯达唑相同,但驱虫活性更强。奥芬达唑与阿苯达唑同为苯并咪唑类中,属内服吸收量较多的驱虫药。但反刍兽吸收量明显低于单胃动物,而且舍饲反刍兽比放牧时吸收量多。牛用药后1018天,牛肝中残留量从
12、55.5g/kg降低至10g/kg。羊用药后1024天,羊肝中残留量从476g/kg降低至12g/kg。奶牛内服2.5mg/kg后1天,奶中的残留量为最高(0.49mg/kg),休药8日则降低至0.005mg/kg;在4872h内奶中主要代谢物为芬苯达唑砜。休药期为牛11天、羊21天,产奶期禁用。,7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ),别名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,为白色或类白色粉末,无臭,无味,在丙酮或氯仿中微溶,在乙醇中凡乎不溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。高效广谱驱虫药,系苯并咪唑类药物中驱虫谱较广、杀虫作用最强的一种,对各种线虫、绦虫均有高度活性,对虫卵发育也有显著抑制作用。因
13、不溶于水,故在肠道内吸收缓慢。,原药在动物体内的主要代谢产物为阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑-2-氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者为杀虫的活性成分。在体内分布量依次为肝、肾和肌肉占内服后血药达峰时间为24h,并且持续1524h。原药与亚砜代谢物在血中的浓度极低,半衰期为8.510.5h。24h内约85%的给药量经肾排出,13%随粪排出。,牛和羊残留消除研究表明,用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很大,刚开始时主要为亚砜代谢物,接着是砜类和氨砜类代谢物。用药后在日内牛肝和牛肾中的残留物有95%为结合态,但羊组织中结合态代谢物很少。奶牛内服10mg/kg后
14、,12h奶中亚砜代谢物残留量达峰值,然后迅速下降,36h时未被检出;24h砜类代谢物残留量达峰值,但消除缓慢,需156h可排净;氨砜代谢物在奶中的量很低,36h达峰值,消除期180h。其他代谢物在服后24h达峰值,48h时低于方法的检测限,但消除期为156h。,8、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ),别名甲苯咪唑,为白色、类白色或微黄色结晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中极微溶解,在水中不溶。为广谱驱虫药,不仅对动物多种胃肠线虫有高效,而且对某些绦虫亦有良效,并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之一。甲苯达唑早在20世纪80年代已广泛用于世界各国的医学和兽医临床。,内服后
15、胃肠道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血浆、肝、肺等,血药达峰时间为24h,半衰期2.55.5h。在动物肝内很少代谢,代谢物为极性很强的羟基(MBZ-OH)和氨基代谢物(MBZ-NH2)。在2448h内经粪便排泄的原形药物约占80%左右,经尿排泄的约为5%10%。吸收后药物,仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。,二、组织中苯并咪唑残留和限量,苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药物本身有关外,还与给药途径、靶组织和消除期有关。标志残留定义为母体药物及其主要代谢产物的总和。阿苯达唑:ABZ用药后,在停药初期,残留物主要为ABZ-SO和ABZ-SO2;而在较长的停药期,主要残留物为ABZ-NH2
16、-SO2,因此标志残留为ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2 的总和,以ABZ计。对FEB、FBZ和OFZ,标志残留为FBZ、OFZ(FBZ-SO),和FBZ-SO2的总和,以FBZ-SO2计。药物消除研究表明,OFZ和FBZ-SO2是组织中最常见的残留物。,在蛋中,氟苯达唑FLU标志残留主要为母体药物,而在鸟类和猪可食组织中标志残留为FLU和FLU-HMET,因此以FLU和FLU-HMET的总量来定义FLU的标志残留。甲苯达唑MBZ标志残留定义为MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2的总和,以MBZ计。残留消除研究表明,MBZ-NH2和MBZ-OH是组织中最持久的残留物,对最高
17、残留限量(MRL)的影响最大。噻苯达唑TBZ标志残留定义为TBZ和5-OH-TBZ的总和。在动物可食组织中,TBZ的母体药物是最常见的残留物,但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯结合物为主要残留。,三氯苯达唑TCB标志残留定义为TCB、TCB-SO和TCB-SO2的总和。TCB禁止用于泌乳期动物,由于TCB-SO2消除时间长,因此它可以作为残留监测的目标化合物。奥苯达唑OXI标志残留为母体药物。其他苯并咪唑类药物,如CAM、LUX、PAR和BEN,在欧盟禁止用于动物源食品,因此欧盟未规定MRL值。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)。,部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量
18、(MRL),三、样品处理,苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性,在适当的pH条件下,分子可以质子化(pKa约56)或去质子化(pKa约12)。在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶于水性溶剂,并被提取,然后调节pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范围内都能电离,易溶于酸性或碱性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。,对于CAM、TCB和TCB代谢产物,它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时,控制溶液的pH值尤为重要。三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、TCB-SO2和CAM分别在pH7.310.9、5.09.0、3.88
19、.0和7.411.1呈中性,因此,只有当pH7.48.0时,所有这些分子都呈中性。大部分苯并咪唑类药物在pH8时都呈中性,当预测某些苯并咪唑类药物的pKa约为8时,这时欲对这些组分同时提取变得相当困难。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH8.6和8.3,以非电离形式存在。,1、水解,肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80110,在14h即可完成水解。酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而被广泛采用。,酶水解,酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫
20、酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使用-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于一定温度下孵育1872h。与酸水解相比,酶水解比较温和,一般不会引起药物的分解,但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。,Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏1h)水解,释放出游离的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等对TBZ在蛋鸡和奶牛中代谢产物进行了研究,发现结合物主要是硫酸酯结合物。Markus等对肝样中的AB
21、Z及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解,释放出游离的ABZ-NH2-SO2。Coulet等对组织中的TBZ蛋白结合物用碱解方法水解。,2、提取及净化,液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。,例如,MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH7.5时,这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性
22、的-OH,其pKa为9.8,在pH7.8时不被电离。因此,溶液只有在pH7.57.8间,所有化合物不被电离,呈中性,这时可用极性溶剂(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)来提取。,(1)血浆、血清或其他生物液体,生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。Bogan等将血浆样品调节至pH7.4,用乙酸乙酯来提取FBZ、OFZ和ABZ。Hoaksey等将血浆样品用乙腈脱蛋白,再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。Alvinerie用乙酸乙酯提取血浆中TCB、TCB-SO和TCB-SO2,以及TBZ和5-OH-TBZ,直接用HPLC-UV测定。,Allan等将血浆样品用酸性溶液稀释
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