流式细胞仪原理及应用ppt课件.ppt

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1、致：,流式细胞术概述,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位,流式细

2、胞仪的原理,液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。,光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号,电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者,散射光信号,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forw

3、ard Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪的检测信号,荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,数据存储,FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE双染样本

4、,数据显示,直方图（Histogram）二维点图（Dot Plot）等高线图（Contour Plot）密度图（Density）三维图（3D Plot）等,单参数直方图分析,数据分析,直方图分析,多参数散点图分析,数据分析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,流式细胞仪的应用,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究血小板分析（心脑血管疾病）细胞周期和倍体分析细胞凋亡干细胞研究树

5、突细胞研究肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究放疗/化疗疗效的研究,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,

6、淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts 评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前1-5天，活化T和

7、Th/Ts持续，1.2预示急排；Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂；实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴T、Th/Ts，放/化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）,临床意义判断病人的机体免疫状态,常见疾病的T 淋巴细胞的变化：,CD4+CD8+CD4+/CD8+类风湿性关节炎（活动期）系统性红斑狼疮-或（活动期）多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 上呼吸道感染,常见疾病的T 淋巴细胞的变化,CD3+CD4+CD8+CD4+/CD

8、8+肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎,淋巴细胞亚群双色分析,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亚群分析,27-51%,15-44%,50-84%,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化,TriTEST/MultiTest与T淋巴细胞绝对计数,使用三色试剂或四色免洗试剂样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，减少细胞丢失绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度单平台计数报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝

9、对含量和H/S比值,TriTEST CD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数,%T LymphCD3+Abs CntCD3+CD4+%T LymphCD3+CD4+Abs CntCD3+CD8+%T LymphCD3+CD8+Abs CntT H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,淋巴细胞活化功能研究,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞因子,CFSE示踪原理,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内

10、的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。体内、体外实验均可以应用,Dilution of CFSE with cell division,Lyons and Parish,1994JIM,171;131,Divisions:3 2 1 0,CFSEFL-1(Log),Divisions:3 2 1 0,葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞

11、因子,T细胞激活抗原表达的动力学曲线,FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,HIV病程进展,应用实例：HIV病例T细胞活化检测,淋巴细胞活化功能检测的广泛应用,结合淋巴细胞亚群分析免疫调节:病因学研究:AIDS、感染、肿瘤、自身免疫性疾病药物筛选/疫苗疗效评价各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营养失调、创伤、手术、烧伤、放/化疗等,T细胞的细胞因子分型,型介导细胞免疫反应引起迟发过敏反应、巨

12、噬细胞活化、2型反应下调刺激来源：病毒、某些细菌型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源,细胞因子相关的主要研究领域,肿瘤肾炎感染自身免疫病超敏反应移植排斥反应免疫缺陷病血液疾病,活化的淋巴细胞分泌细胞因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,Activation 37 Incubation,Intracellular Stain,Lyse/Fix,Acqusition,Permeabilize,lymphocyte,erythrocyte,stimulus,Surface Stain,W

13、ash,cytokine,Wash,Wash,protein blocking,基于细胞水平的研究胞内因子胞外因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,应用实例：分析1型与2型免疫反应,分析结核菌感染12周后用PBS(a),PPD-B(b),BCG（卡介苗）(c),or M.bovis(d)分别刺激的结果。B结果,CytometricBeads Array(CBA)系统胞外细胞因子检测系统,简介,CBA是一系列荧光强度不同、包被有捕获抗体的微球，类似于ELISA的捕获孔板，可以捕获相应的抗原，再结合第二种荧光检测抗体，形成一种双抗体夹心结构，能结

14、合上，就能发出荧光来，从而检测到相应的抗原。简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。应用领域：主要用于血清、血浆、培养细胞上清、眼泪或房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析,How to analyze soluble proteins in FCM?,+,+,待分析的可溶性抗原,荧光标记的检测抗体,捕获微球,捕获抗体,Bead,微球体标记技术&FCM,技术基 本 原 理,CBA,捕获微球可溶性抗原检测抗体 三明治复合物,Cytometric Bead Array multiplexed beads,1,2,3,不同强度红

15、色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。荧光强度即为靶蛋白量,4,7,5,6,Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit,No sample added inDetector antibodies only,Chemokine-I CBA Assay Standard,0 pg/ml,CBA Assay Standard,10 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,20 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,

16、Chemokine-I CBA Assay Standard,80 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,156 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,312 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,625 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,1250 p

17、g/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,2500 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准曲线,5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,80 pg/ml,20 pg/ml,IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-,IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-,操作步骤,检测物与捕获微球共孵

18、育。洗涤。标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）。洗涤。流式细胞仪上机检测。CBA分析软件批量数据分析。,与传统的ELISAs检测相比,能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测较传统检测节省样本量（50l）与ELISAs相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应所致人工假象强大的CBA分析软件节省操作时间、检测时间和分析时间,。,BD CBA新产品系列BD CBA Flex Set-New,基本原理与CBA Kit相似检测原理不同：Flex Set微球种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通

19、道检测，通带有近红外和红色两过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。,CBA Kit与CBA Flex Set,CBA Kit同时检测5或者6个全部试剂CBA Analysis Software检测指标组合固定,CBA Flex Set最多达75个需另购Buffer kitFCAP Array Software检测指标可自由组合,CBA/CBA Flex set的应用领域,血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析免疫细胞功能性研究免疫疾病的监控疫苗研发，药效评价

20、，总体免疫功能分析传染性疾病肿瘤研究,HLA-B27分析,HLA-B27,HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病、银屑病性关节炎、葡萄膜炎等也有明显表达 使用流式细胞仪，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27 BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%,HLA-B27,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,流式细胞仪的应用（血液）,白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数网织红细胞的分析阵

21、发性血红蛋白尿（PNH）诊断血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析血小板自身抗体检测网织血小板计数,白血病免疫分型,FAB分型：AL分为AML（M0-M7）&ALL白血病的MICM分型 Morphology Immunology Cytogenetics Moleculor Genetics 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,白血病细胞特性：,白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常 异常抗原表达(Aberrati

22、on Antigen Expression)丧失系列规律性（lineage infidelity)过高，过低，不表达，交叉 丧失分化发育的阶段性（differentiation asynchrony)早期与晚期抗原同表达,白血病免疫分型抗原,常用白血病细胞系列与分化阶段抗原,白血病细胞系列非特异性抗原：干/祖细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38-原始细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38+幼稚细胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+）,白细胞共同抗原：CD45,CD45的临床应用,CD45是白细胞的共同抗原成分。其分子量介于180220Kda之间，属于T200家族。所有人类白细胞

23、均表达CD45，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化程度高的细胞CD45表达量高，分化程度低的细胞CD45表达量低（淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,CD45的临床应用,用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群体，当幼稚细胞达70-80%时，即可

24、大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞B淋巴细胞：CD45+、CD10

25、-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞：CD45+、CD（16+56）+/CD3-单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,正常人骨髓细胞免疫表型,淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞）单核细胞:CD45+,CD34

26、-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系细胞:原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异巨核细胞：CD45+、CD41+/CD61+幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+,T-ALL免疫表型,B-ALL免疫表型,HL,A,-,DR,CD19,CD10,CD20,CD22,CD79,a,其它,早期前,B,-,ALL,+,+,-

27、,-,C,+,/M,-,+,34/38,+,普通型ALL,+,+,+,-,C,-,/M,+,34/38,前,B,-,ALL,+,+,+,+,B,-,ALL,+,+,-,+,+,+,Kappa,+,/,Lambda,+,*,CD10,+,的,ALL,疗效好，有,CD34,+,病人往往合并,t(9,22),需强化治疗,成熟,AML免疫表型,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,FCM在临床血液学中的应用,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7诊断双

28、系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病（如HCL）,免疫分型 对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。,阵发性血红蛋白尿PNH,阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血患者体内红细胞呈不均一性利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒

29、细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例,阵发性血红蛋白尿PNH,正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性PNH患者血细胞分为三型：型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间 型：CD59表达完全阴性分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度,红细胞 PNH分析,A 正常人B D 病人,网织红细胞计数Retic-COUNT,操作快速、简便计数精确低水平网织红细胞检测网织红细胞成熟指数IRF,临床应用：预测骨髓移植效果判断贫血发病原因评价生物制剂的疗效,网织血小板的检测

30、,人们最先于1969年指出网织血小板是一类能被新亚甲蓝深染的血小板。如网织红细胞一样它们是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人们发现网织血小板为骨髓新释放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中网织血小板的多少，可以间接反映骨髓巨核系造血的活跃程度。并能用常规的检测网织红细胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式细胞仪上方便、准确地检测。,临床应用,正常人网织红细胞1.07%缺铁性贫血（IDA)4.78%,临床应用,再障（AA)0.03%溶血性贫血（HA)29.33%,造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。造血干细胞的特征是：大小（FSC）和颗粒度（S

31、SC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似细胞内含有较多核酸物质 CD34表达弱阳性或强阳性 CD45表达弱阳性在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数,造血干细胞计数,干细胞移植应用,血液系统病症:L&L,再生障碍想贫血恶性肿瘤:乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌遗传性异常病变免疫缺陷:血红蛋白病,血小板检测,血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病CD41-CD61复合物：血小板无力症CD42a-CD42b 复合物：巨大血小板症血小板活化的相关检查血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板减少性疾病血小板自身抗体检测网织血小板的检测血小板脱落微粒的检测,血小

32、板活化,IIb/IIIa复合物（CD41/CD61）在所有静止和活化的血小板上都有表达血小板活化时发生的改变IIb/IIIa复合物发生变构，表达PAC-1血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达CD62P,CD61圈血小板门PAC-1/1：阴性对照，静止的血小板PAC-1/CD62P：试验管，ADP刺激下活化的血小板，报告血小板活化百分含量,血小板活化,血小板活化,直接测量循环血小板活化状态与反应性可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关预测冠状动

33、脉成形术后发生急性缺血事件的危险性缺血性脑血管病与血小板活化有关子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治疗疗效监测,脑栓塞病人血小板活化检测,A CD61-SSC设分析门B 阴性对照C 治疗前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%,血小板无力症（CD41缺陷，PAC-I下调）,巨血小板症,蓝阴性对照绿正常人红病人CD41表达上调CD42a/CD42b缺失,血小板自身抗体 ITP病人,DNA细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞

34、数量,DNA细胞周期分析参数,DNA倍体性Ploidy 细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid 正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数（DI）测定标本的G0/G1期细胞DNA含量 与同种系正常细胞的G0/G1期细胞 DNA含量的比值，表示细胞倍体性S期含量SPF S期细胞占总周期细胞的比例增殖指数PI 增殖细胞占总周期细胞的比例CV G0/G1期细胞DNA含量变异系数,DNA分析的临床意义,DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰S期细胞含量10-15%DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，提高治愈率和生存率。尤其对一些

35、细胞抽吸物、体液、组织液、灌洗液脱落细胞的分析，意义尤为重要。研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系。提示肿瘤患者预后。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。,FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在淋巴瘤（L&L）病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,FCM参数的预后意义,DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子

36、宫内膜癌、皮肤黑色素瘤S期比率与肿瘤组织学分级密切相关：肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤,细胞凋亡PI分析,PI-Fluorescence,#Events,凋亡细胞,正常G0/G1期细胞,128,正常DNA倍体分析,129,Aneuploid peak,DNA异倍体,秋水仙素处理罗田甜柿获得12 倍体再生植株,正常人骨髓细胞DNA周期分析（ModFIT）,132,肿瘤细胞SPF(S期含量),肿瘤细胞(单克隆)(14.18%),正常骨髓细胞(2.93%),肿瘤细胞(多克隆)(28.52%),乳腺癌及乳腺良性病变的流式检测对比分析,细胞凋亡,细胞凋亡的

37、分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查DNA Ladders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程（HIV、自身免疫性疾病、肿瘤）研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对凋亡的影响,凋亡检测-每一步都有检测试剂盒,细胞凋亡检测,凋亡相关细胞膜变化的检测凋亡相关线粒体变化的检测凋亡相关酶活性的检测凋亡相关DNA片段的检测凋亡相关基因蛋白的检测,细胞膜变化的检测早期凋亡,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，DNA不断裂线粒体膜电位变化的检测细胞内氧化还原状态改变的检测,细胞膜变化的检测,磷脂酰丝氨酸（PS）的检测早期凋亡,早期凋亡PS检测及结果判断,早期凋亡特征磷脂膜（

38、PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂 结果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡：AnnexinV+/PI+正常的活细胞：AnnexinV-/PI-,ANNEXIN-V/PI检测,142,ANNEXIN-V/PI检测,control,处理16h后,处理24h后,线粒体水平检测相关产品,线粒体膜电位的检测BD Mitoscreen（JC-1）Cat#551302 25tests原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光。操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟

39、后检测,JC-1 检测结果流式图,凋亡相关酶活性的检测,背景知识细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解 Caspase 3激活=细胞凋亡检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性。,CBA分析凋亡信号通路,DETECTORANTIBODY,LYSATE ORSUPERNATANT,BEADS,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Wash,Read on Flow Cytometer,Active

40、Caspase-3,Bcl-2,Cleaved PARP,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本和检测抗体孵育后，形成“三明治”复合物,Active Caspase-3,Bcl-2,Cleaved PARP,Bcl-2、Caspase-3、PARP构成的凋亡调控通道主要蛋白，对于凋亡研究具有特殊的意义(CBA Human apoptosis kit 557816),流式检测活性Caspase-3,相关产品：Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破膜液，洗涤液和PE标记抗体；特点：细胞需要固定破膜，然后才能染色,149,化疗前

41、后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞,化疗前(3.49%),化疗后(94.86%),DNA水平的凋亡检测-晚期检测,凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段检测方法Tunel流式法，通过在核酸片段末端标记，跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比DNA Ladder分析，但凋亡细胞太少时作不到,TUNEL简介,通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP（多为dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通过荧光检测定量分析结果。,TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nic

42、k-end-labeling）,152,DNA断裂点检测,TUNEL法流式分析凋亡结果,154,BrdU-FITC/PI检测,S期,凋亡检测总结,检测水平 细胞 核酸 细胞膜 胞内通路 线粒体,微生物,微生物,细菌的计数检测与鉴定（CBA)血清血诊断(CBA)抗生素敏感性实验,细胞活力检测（细菌活力）,图 流式细胞术分析GFP转染效率和表达量,调节性T细胞研究进展,免疫耐受机制,以往研究认为：（“被动”方式）胸腺细胞及前B（pre-B）细胞在中枢免疫器官中的克隆清除 进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性 部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视,

43、免疫耐受机制,近年研究表明：（“主动”方式）调节性T（Tr）细胞以“主动”的方式维持自身免疫耐受,这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响。,调节性T细胞的特异性标志,FOXP3（Forkhead box protein P3）是一个50kD的转录因子，也称为Scurfin、JM2、IPEX。它是一个主要调节基因。CD4+/CD25-细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR、CD103和CTLA4的表达，并且促使调节性T细胞表型形成。FOXP3在X连锁自身免疫过敏失调综合征（XLAAD或IPEX）患者中发生突变。FOXP3过度表达会引起机体

44、的免疫应答下降，表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子。FOXP3表达于细胞内,调节性T细胞分类,根据来源、特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞天然性调节性T细胞：在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有510的细胞持续高表达CD25分子，该群细胞从胸腺中发育，组成性表达foxp3，在体内外发挥免疫调节功能获得性调节性T细胞：是由外周T细胞在特定的条件下分化出来，通过分泌高水平的IL-10和 TGF-而发挥其抑制功能.,Regulatory T Cells Background:its Development,Thymus,Periphery,T cell

45、 precursor,Tr1,Th3,FoxP3-,?,iDC and/or in thePresence of IL-10And/or TGFb,Conventional T cell,Nave T cell,Naturally occurring Treg cell,Adaptive Treg cell,CD25,GITR,FoxP3+,CD4,CD127,CD25,GITR,FoxP3+,CD4,CD127,FoxP3-,人Tr细胞表达特征：CD127+,CD127是非二聚体IL-7受体CD127表达于胸腺细胞，T、B祖细胞，成熟T细胞，单核细胞及其它淋巴细胞和骨髓细胞T细胞活化后CD1

46、27表达下调CD127表达下调发生在Tr细胞CD127下调同时CD25高表达、FoxP3+为Tr细胞CD127优于传统的FoxP3+保证了细胞的活性,从Human PBMCs中分离Tr细胞,FoxP3染色确认Tr细胞,FoxP3染色确认Tr细胞,小结,CD127弱表达FoxP3+CD127loCD25hi-intCD127和FoxP3联合应用于Tr细胞的功能性研究（体内体外）,树突状细胞（dendritic cell，DC）,DC的生物学特点,DC因其具有膜样或树突样突起而得名DC包括郎罕氏细胞、间隙DC、滤泡DC（FDC）、并指DC（IDC）等等。其在体内含量甚微，仅占外周血单个核细胞（PB

47、MC）的1以下，但分布非常广泛，在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中都有存在。,DC的生物学功能,DC是一类抗原呈递细胞（APC），在捕获和处理抗原后，将抗原递呈给特殊的初始T淋巴细胞，引发初次免疫反应，在诱导免疫耐受和调控免疫活性方面扮演着重要角色，DC是机体内惟一能激活初始T细胞的APC。DC还可以通过激活巨噬细胞，NK细胞，NK样T细胞和嗜酸性粒细胞引发机体对入侵感染因素的反应，从而连接天然免疫系统和适应性免疫系统DC受细胞因子调控的同时,本身也可产生多种细胞因子,如IFN-,IL-12,GM-CSF,IL-1,IL-6和TNF-等,DC将Ag提呈给初始T细胞,DC的表面标志,人DC

48、的主要特征性表面标志为CD1a和CD83，CD83还是DC充分成熟的标志。成熟DC高表达CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表达或低表达这些分子未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体所有DC共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如HLA-DR，DC成熟过程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面。,DC体外诱导分化,监控DC成熟度的监控,BD Multicolor MDDC phenotyping reagentCD209(DC-SIGN)：DC独有标志CD83：充分成熟标志CD86：DC

49、成熟过程中表达增加,小鼠DC,小鼠DC的标志是CD11c，成熟DC也有MHC-和CD80，CD86的表达小鼠DC前体主要分为两类：功能上等同于人MDC和PDC小鼠DC制备：小鼠骨髓BD IMag Mouse Dendritic Cell Enrichment Set大鼠DC：常用标志OX62，OX6（MHC-），CD80，CD86等,树突状细胞分泌的细胞因子,DC分泌的细胞因子有很多种，但各种细胞因子与DC功能的相关性尚在探讨中,DC临床和科研应用1,肿瘤发生发展机制的探讨DC瘤苗研发将经肿瘤抗原（如肿瘤抗原多肽、肿瘤细胞或裂解成分、肿瘤和DC融合的杂交细胞、肿瘤特异表达的mRNA）在体外冲击致敏的DC回输体内，再与自体T细胞共育，有利于打破免疫耐受，有效诱导CTL介导的特异性抗肿瘤免疫应答。已用于黑色素瘤，前列腺癌，肾癌，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，妇科肿瘤，恶性脑神经胶质瘤等的临床治疗实验病毒感染移植物抗宿主反应过敏和超敏反应自身免疫性疾病,帮助全人类健康生活,谢谢！,