流式细胞仪的应用ppt课件.ppt

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1、流式细胞仪的应用,主讲人：王银,流式细胞术在基础研究中的应用,细胞活力的检测细胞周期分析细胞凋亡分析多药耐药基因研究（MDR）RNA测定、DNA测定细胞内离子的测定及pH值测定,流式细胞术的临床应用,白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验,guava easyCyte 8HT 微毛细管细胞分析仪 厂家：Millipore获奖理由：突破性的微毛细管技术，无需鞘液，样品体积少，废液更少，让细胞分析变得更简单、快捷、易于操控,4,细胞活力的检测,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活

2、细胞所占的百分比叫做细胞活力。,Dead Cell Discrimination,Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flow cytometer.Cells are incubated on ice for 1-5 minutes in PI at a final concentration of 2ug/ml.,细胞周期分析,在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和增殖能力。DNA含量常和某种细胞周

3、期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA content,Count,G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞DNA 含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4N值，即为四倍体

4、细胞群。,G0-G1,S,G2-M,Fluorescence Intensity,#of Events,A typical DNA Histogram of cell proliferation,样品制备,1000rpm 5分钟收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5ml PBS悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton),1000rpm 5分钟 离心,两次,混匀，室温静止5分钟,上机,经RNA酶处理前后的比较,RNA也是核酸，也会被PI染色，为

5、避免干扰,染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。,结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43S期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。,应用D

6、NA含量测定鉴定细胞凋亡,如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。,Flow Cytometry of Apoptotic Cells,缺乏IL-3诱导的细胞凋亡,在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰,上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色）,上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分布的抛物线（蓝色）,流式细胞术在生殖医学中的应用,精子细胞和精子为

7、单倍体细胞1C;次级精母细胞为二倍体细胞2C;初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C,细胞凋亡分析,细胞凋亡,特点：染色质的浓缩,核膜及细胞膜的内陷,接着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小，而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。,在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化,早早期凋亡的检测-capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡-“TUNEL”法晚晚期凋亡-DNA含量分析法,caspase-3,Caspase家族在介导细

8、胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。,Massive substrate cleavage,Apoptosis Signaling,Receptor,Flow Cytometric Analysis of Apoptosisin Jurkat T

9、Cells,Relative Cell Number,Active Caspase-3FITC,0 0.5 1 2 4,Incubation with Camptothecin喜树碱(hr),早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡-“TUNEL”法晚晚期凋亡-DNA含量分析法,Annexin-V-FITC/PI双染法,正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的PS迁移到细胞外层表面。Annexi

10、n V是一种对Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。,Annexin V Assay,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚,Annexin-V-FITC/PI双染法,由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非

11、活细胞，即坏死细胞，为Annexin V+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V+/PI-。,Annexin V Assay区分死亡与凋亡,Annexin V-PI Analysis,Camptothecin:喜树碱，抗肿瘤药物,实验步骤,1.离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。2.用冷PBS洗涤细胞两次。3.用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。4.在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8C避光条件下孵育15分钟。5.加入10ul PI后轻

12、轻混匀，于2-8C避光条件下孵育5分钟。6.在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡-“TUNEL”法晚晚期凋亡-DNA含量分析法,原 理,细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。,凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（JC-1 Apoptosis Detection Kit）,采用一种阳离子

13、脂质荧光染料JC-1作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，单体在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，多聚体在流式细胞仪红色（FL-2）通道检测出红色荧光。JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（y）具有极性，JC-1依赖于y的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，发射红色荧光。而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。,凋亡诱

14、导剂诱导P388细胞凋亡，利用凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析分析结果。正常细胞FL-1亮,FL-2亮;R1，凋亡细胞 FL-1亮,FL-2暗;R2,R1,R2,R3,R4,R1,R2,R3,R4,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡-“TUNEL”法晚晚期凋亡-DNA含量分析法,原 理,细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链DNA 会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列3-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl t

15、ranferase,TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP连接到DNA的3-OH末端，用流式细胞术检测。,BrdUrd Incorporation,BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时,就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体显示。该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量,而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。,（5

16、-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷),Br-dUTP,Br-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。未凋亡的细胞因为没有暴露的3未端，所以不会被检测。,TUNEL Assay,TUNEL Assay,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡-“TUNEL”法晚晚期凋亡-DNA含量分析法,细胞凋亡时，细胞核，细胞器及细胞膜成分，

17、细胞形态均发生了改变。由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞的DNA可染性发生改变。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。,细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测,（1）Fas/FasL(Fas 配体)：Fas 抗原与Fas 配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径，它们的异常与免疫相关疾病、肿瘤、移植排斥、病毒性肝炎、肾小球肾炎等多种疾病高度相关。（2）p53：p53 是细胞周期中的检查点分子，其控制着细胞在DNA 损伤无法修复时启动

18、细胞的自杀进程。p53 的缺失或突变已被证明是多种肿瘤（如：乳腺癌、胃肠道肿瘤及肝细胞癌等）发生的重要原因。其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标。（3）Bcl-2：Bcl-2 是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切关系。其表达上调是肿瘤诊断的指标和预后的参考。,多药耐药(multidrug resistance,MDR)是由一种药物诱发而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生的交叉耐药，既对广泛的结构和功能不相同的抗肿瘤药物产生的耐药，导致某些联合化疗方案失败。,肿瘤多药耐药性(multidrug resistance MDR)检测,P170 糖蛋白,MDR基因

19、编码的产物P糖蛋白是分子量约为170Kda的胞膜蛋白。P糖蛋白具有一种能量依耐的跨膜药物外输泵功能，当肿瘤细胞与抗癌药物接触时，脂溶性药物浓度梯度进入细胞，而P糖蛋白则结合药物分子，同时其ATP结合位点连上ATP，ATP水解后释放能量将药物从胞内泵出胞外，药物在胞内浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。,用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物P170,【摘要】：为研究检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物，采 用间接标记法，用鼠抗人单克隆抗体，二抗为标记兔抗鼠，应用流式细胞仪检测了例新鲜实体肿瘤组织和一株多药耐药的细胞 株。结果显示：例肿瘤细胞表达，其阳性率为.

20、，例未检出表达，其阴性率为；细胞表达。在 例阳性表达的样本中，有例阳性表达百分比低于；只有例高于。提示大多数肿瘤组织细胞表达阳性率高，但表达 肿瘤细胞表达百分比低。检测肿瘤组织的表达能为临床治疗提供一个可靠的参考指标。,Fluo-3-Am为一新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化，Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。,细胞内Ca2+浓度测定,检测淋巴细胞引起的细胞毒作用

21、,细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性T细胞CTL和自然杀伤细胞NKC）能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过Fas-Fas连接作用于靶细胞，引起靶细胞内Caspase酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和应用价值。流式细胞术测定细胞毒作用(FCC)，利用Caspase专一性荧光底物测定受害细胞的细胞毒作用强度。准确简便迅速。,DNA、RNA 的测定,临床研究,淋巴细胞亚群测定造血干细胞研究肿瘤相关基因表达研究血小板分析白血病和淋巴瘤免疫分型HLA-B27分析PNH诊断,淋巴细胞亚群测定,淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋

22、巴细胞亚群包括T淋巴细胞(CD3+),T 辅助细胞(CD3+CD4+),T 抑制细胞(CD3+CD8+),B 淋巴细胞(CD19+或CD20+)，NK 细胞(CD3-CD56+)等。,(1)首先用CD3来区分全部T细胞。CD3/CD4 双阳性的细胞为真正的辅助/诱导性T细胞。这些细胞主要是HIV病毒感染对象。在HIV感染后，随着疾病的发展出现免疫抑制后，这群细胞会明显减少；在临床中，对HIV的监测主要依靠检测这群细胞的数量.(2)CD3-/CD4+细胞群体是由单核细胞组成的。这些细胞相对于CD4+和T细胞来说弱表达CD4，在光散射参数的位置分布也较广。CD3/CD4抗体组合能完全将CD4阳性辅

23、助/诱导性T细胞与CD4阳性的单核细胞区分开来。因为CD4+T细胞能与单核细胞完全分离，故在光散射坐标上设淋巴细胞“门”时，“门”可设得大一些，即使包含了单核细胞或其他细胞都不会影响检测值。,细胞表型的检测,淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;单核2-6%粒细胞:40-60%,淋巴细胞亚群分析,淋巴细胞是免疫系统中执行免疫功能的重要细胞，各种白细胞分化抗原（CD）分子广泛分布在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞。免疫细胞表面标志改变与细胞的活化和功能的改变有着密切关系，不同类型免疫细胞间的比例也对机体免疫功能具有重要的影响，而这些变化与临床疾病的病理变化密切相关。,Pe

24、ripheral White Blood CellsCD45+,1、Th 细胞：CD3+CD4+CD8-T细胞，能辅助B细胞分化成熟,产生抗体,参与促进细胞介导的免疫应答。,（一）淋巴细胞及其亚群分析,2、Tc细胞：CD3+CD4-CD8+T细胞，能特异性直接杀伤靶细胞，所有表达MHC I类分子的靶细胞。抗肿瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反应和自身免疫疾病中均起了重要作用。,B细胞膜表面免疫球蛋白（Smlg）。表达CD19、CD20、CD21、CD22分子。B细胞也是免疫系统重要的免疫细胞，主要功能是介导体液免疫。,(二）B淋巴细胞及其亚群,NK 细胞为一组大颗粒的淋巴细胞，标志CD16,CD5

25、6,CD2、CD11a/CD18.CD3-CD16+CD56+淋巴细胞定为NK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。,（三）NK细胞分析,淋巴细胞亚群检测的临床意义,总T和总B及其亚群的意义 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。对CD4和CD8T细胞的测定有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应的监测。CD4/CD8的意义 评价自身免疫失调、免疫失调或免疫缺陷病病人的免疫状态，（自身免疫病比值升高，病毒感染、肿瘤、再障比值降低）。NK细胞的意义 NK（7-40%）细胞能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,HIV AND AID

26、S,细 胞 内 因 子 的 检 测,Th1/Th2细胞,PMA（佛波脂）+Ionomycin（依诺霉素）刺激4-6hr,流式细胞细胞因子分析图,肿瘤相关基因的表达,P53/Bcl-2,P53控制着在DNA损失无法修复时启动的“自杀”进程。P53的缺失或突变已被证明是多种肿瘤发生的重要原因。它表达的高低是肿瘤诊断及预后的重要指标。Bcl-2 是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切的关系。表达上调是肿瘤诊断的指标和预后的参考。nm23与多种肿瘤的转移及预后相关。,造血干祖细胞检测,CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。,上图中红色群体是经过多参

27、数设门后精确设定的CD34阳性细胞群体，绿色部分是进行定量计数的标准微球。,血小板的测定,白血病和淋巴瘤免疫分型,正常白细胞在其分化过程中，随着系列的不同、成熟阶段的差异，会在细胞膜表面表达不同的分化抗原。白血病细胞则在癌变的过程中，丧失了正常细胞的系列专一性和分化阶段规律性，在本质上有别于正常骨髓细胞。应用此特点可进行免疫表型分析，以鉴别各种白血病和淋巴瘤，辅助临床诊断、评估疗效和预后。常用的抗原包括：CD3、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD10、HLA-DR、CD13、CD14、CD33、CD34、GLY-A、MPO等等。,左图为正常骨髓，绿色为正常淋巴细胞，深红为单核细

28、胞，玫瑰红为成熟粒细胞，浅蓝为有核红细胞，深蓝为未成熟细胞；右图为急性髓性白血病图形，可见与正常明显的差别。,HLA-B27 的分析,正常人,患 者,HLA-B27,发病机制：为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚连蛋白合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏。诊断：主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。,阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）,网织红细胞测定,计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量 RNA残留在细胞浆

29、内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.01.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5151010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高.可避免人为误差.因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠.同时可给出网织红细胞年龄结构。流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(PyroninY)丫啶橙(AcridineOrangeAO)碘化丙啶(PropidiumIodinePI)花青(Cyaninedye)等。,细胞分选系统,细胞分选,谢谢大家！,