蛋白质的空间结构课件.ppt

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1、蛋白质分子的高级结构,蛋白质分子的高级结构,蛋白质分子中的结构层次一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基 四级结构,蛋白质分子中的结构层次,定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级(共价)结构,主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,定义一、蛋白质的一级(共价)结构主要的化学键,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,N末端C末端牛核糖核酸酶,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构,蛋白质的根本差异在于一级结构的不同,胰岛素的一级结构 蛋白质的根本差异在于一级结构的不同,多肽链中氨基酸序列分

2、析一级结构测定,准备工作：样品纯度97%以上；测定蛋白质的相对分子质量（允许误差10%左右）测定肽的数目；测定氨基酸组成,多肽链中氨基酸序列分析准备工作：,多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（纯度97%以上）,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序结果。,多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,胰蛋白酶：水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键；糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶

3、）：水解芳香族氨基酸【苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）】等氨基酸残基的羧基形成的肽键。胃蛋白酶：专一性较差，主要水解Glu、Asp或其他氨基酸的侧链。,胰蛋白酶：水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键；,则其氨基酸排列顺序为：Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys,如测一个九肽,测得N端氨基酸残基为Thr,又分别测得片段:Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys,则其氨基酸排列顺序为：如测一个九肽测得N端氨基酸残基为Thr,例1：某五肽先经酸水解再经碱水解，得到摩尔数相等的五种氨基酸（

4、Ala、Cys、Lys、Phe和Ser）混合物，用Edman分析法进行N端分析，获得PHT-Ser；经胰蛋白酶水解可得到一种N端为Cys的三肽和另一种N端为Ser的二肽；用胰糜蛋白酶水解上述三肽，得到Ala和另一个二肽。问该五肽的氨基酸顺序怎样？,解答：1、是一个N端为Ser的五肽；2、胰蛋白酶的水解部位是Lys或Arg的羧基端肽键，因为得到一种N端为Ser的二肽，因此第二位为Lys；3、经胰蛋白酶水解可得到一种N端为Cys的三肽，所以第三位为Cys；4、因为胰糜蛋白酶只水解芳香族氨基酸的羧基端肽键，水解上述三肽，得到Ala和另一个二肽，所以三肽为：Cys-Phe-Ala5、整个五肽的顺序为S

5、er-Lys-Cys-Phe-Ala。,例1：某五肽先经酸水解再经碱水解，得到摩尔数相等的五种氨基酸,例2：当一种4肽与FDNB反应后,用5.7mol/L HCl水解得到DNP-Val及3种其他氨基酸;当这4肽用胰蛋白酶水解时发现有两种碎片段，其中一片用LiBH4还原后再进行酸水解,水解液内有氨基乙醇和一种在有浓硫酸条件下能与已醛酸反应产生紫(红)色产物的氨基酸.试问这4肽的一级结构是由哪几种氨基酸。（LiBH4还原羧酸成为醇类，可使C-末端AA还原为相应的氨基醇。）,1、分析：FDNB即2，4-二硝基氟苯，在弱碱性溶液中可与肽链N-末端的氨基酸生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。盐酸水

6、解可以打开所有的肽链，使蛋白质或者多肽变为游离的氨基酸。LiBH4还原羧酸成为醇类，可使C-末端AA还原为相应的氨基醇。胰蛋白酶可专一性水解由碱性氨基酸（lys，Arg）羧基端形成的肽键。,例2：当一种4肽与FDNB反应后,用5.7mol/L HC,解题：（1）四肽与FDNB反应后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val，证明N端为Val；（2）LiBH4还原后再水解，水解液中有氨基乙醇，Gly是氨基乙酸，证明肽的C端为Gly；（3）水解液中有在浓H2SO4条件下能与乙醛酸反应产生紫红色产物的氨基酸，说明此氨基酸为Trp；（4）根据胰蛋白酶的专一性，得知此肽键-COOH末端是Lys或者

7、Arg；根据以上结果可知道四肽的顺序：ValLysTrpGly或者ValArgTrpGly。,解题：,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键：氢键、盐键、疏水键、范德华力,二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即,（一）酰胺平面,参与形成肽键的4个原子（C、O、N、H）和与之相连的2个-碳原子（C1、C2）共处于同一平面上，形成酰胺平面，或称肽键平面，肽平面，肽单元。C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型。,（一）酰胺平面参与形成肽键的4个原子（C、O、N、H）和与之,它是蛋白质构象的基本结构单位,它是蛋白质构象的基本结构单位,（二）蛋白质二级结构的主要形式,-螺

8、旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),（二）蛋白质二级结构的主要形式-螺旋(-hel,1、-螺旋,结构要点:从N端为起点，多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。,1、-螺旋结构要点:,多个肽键平面通过-碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定（氢键是稳定螺旋的主要键），氢键与螺旋长轴基本平行。主链呈螺旋上升，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，沿轴旋转1000，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于上升高度(螺距)0.54nm，螺旋的直径约为0.

9、5nm。,螺旋的结构特点,多个肽键平面通过-碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手,例题：一个螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？计算该-螺旋片段的轴长。解答：180/3.6=50圈，500.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。,例题：一个含有78个氨基酸残基的螺旋的轴长是多少？此多肽的螺旋完全伸展时多长？解答：780.15=11.7nm 螺旋每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，故该螺旋圈数为：783.6圈；螺旋的直径约为0.5nm，故每圈轴长为0.5nm。完全伸展的螺旋长度约为：0.5（783.6）34.01nm,例题：一个螺旋片段含有180个氨基酸残基，

10、该片段中有多少圈,蛋白质的空间结构,多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。,2、-折叠,多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿,-折叠,-折叠结构的肽链几乎是完全伸展的，两段以上的-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行，反平行结构更为稳定。两链间的肽键之间形成氢键，以稳固-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,-折叠-折叠结构的肽链几乎是完全伸展的，两段以上的-,反平行,反平行,平行,平行,3、-转角,蛋白质多肽链经常出现180的回折，这种肽链回折处的称为-转角（-tern）或-bend，或称发夹结构（hairpin struct

11、ure）。,3、-转角蛋白质多肽链经常出现180的回折，这种肽链回折,一般由四个连续的氨基酸残基组成，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。,一般由四个连续的氨基酸残基组成，第一,4、环,环多存在于球状蛋白质分子中，形状像“”，称为环（loop）。由6-16个氨基酸残基组成,4、环环多存在于球状蛋白质分子中，形状像“”，称为环,5、无规卷曲（自由回转）,是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,酶的功能部位常位于这种构象区域,5、无规卷曲（自由回转）是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链,氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链的氨基酸残基的侧链适合形成-

12、螺旋或-折叠时，它就会出现相应的二级结构。,氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结,1、超二级结构（Supersecondary structure）,在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：,（三）二、三级过渡态 蛋白质的超二级结构和结构域,1、超二级结构（Supersecondary structu,2、结构域,多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成较为紧密的近似球状或纤维状、具有部分生物功能的结构，称为结构域(domain)大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或

13、纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。,2、结构域 多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成较为紧密,纤连蛋白分子的结构域,丙糖磷酸异构酶,纤连蛋白分子的结构域 丙糖磷酸异构酶,三、蛋白质的三级结构,（一）定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。由一个或多个结构域组装而成的结构。,三、蛋白质的三级结构（二）主要的化学键（一）定义：整条肽链,蛋白质的空间结构,肌红蛋白(Mb),肌红蛋白(Mb)N 端 C端,亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布、亚基间通过非共价键聚合而

14、成的特定构象，称为蛋白质的四级结构。,由多条多肽链组成的蛋白质，肽链间相互以非共价键联结成一个活性单位，这种肽链就称为该蛋白质的亚基。,亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构蛋白,血红蛋白（Hb）的四级结构,血红蛋白（Hb）的四级结构,从一级结构到四级结构,血红蛋白,从一级结构到四级结构血红蛋白,蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列，维系蛋白质分子的一级结构的键：肽键、二硫键,蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠,Primarystructure,Secondarystructure,蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列，维系蛋白质分子的一级结构的,蛋白质的三级结构是多肽链自

15、然形成的三维结构,蛋白质的四级结构是亚基的空间排列,Polypeptide(single subunitof transthyretin),Transthyretin,with fouridentical polypeptide subunits,Tertiarystructure,Quaternarystructure,蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质的四级结构是,维系蛋白质分子空间结构：疏水键 氢键 范德华力 盐键（离子键）,蛋白质的空间结构,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节

16、,蛋白质结构与功能的关系第 三 节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,天然状态，有催化活性 尿素、去除尿素、非折叠,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val,这种由蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,正常红细胞,镰刀形细胞,这种由蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序发生变异所导致的,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间

17、结构与功能的关系,目 录,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与Mb一样能可逆,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,*协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive coop

18、erativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋,蛋白质的空间结构,O2,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中,变（别）构效应(allosteric effect),某些蛋白质表现其生物学功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别构效应。,变（别）构效应(allosteric effect)某些蛋白,(R)relaxed state,(T)tense state,血

19、液中O2的运输(Hb R/T态的互换),静脉,动脉,环境氧浓度高时Hb 快速吸收氧分子,环境氧浓度低时Hb 迅速释放氧气,任何一个亚基接受O2后，会增加其他亚基吸收O2的能力,释放氧气后Hb 变回 T state,(R)(T)血液中O2的运输(Hb R/T态的互换)L,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋

20、白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病中的蛋白质构象改变PrPcPrPsc正常疯牛病,第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Pu

21、rification of Protein,第四节蛋白质的理化性质与分离纯化,蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀作用蛋白质的变性蛋白质的紫外吸收,一、蛋白质的理化性质,蛋白质的两性离解和电泳现象一、蛋白质的理化性质,1、蛋白质的两性解离和电泳现象,蛋白质分子与多肽、氨基酸一样，除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的两性解离性质使其成为人体及动物体中的重要缓冲剂，调节体液正常pH。,蛋白质,1、蛋白质的两性解离和电泳现象蛋白质分子与多肽、氨基酸一样，,蛋白质的等电点(isoelectric po

22、int,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质较稳定，其溶解度、导电性、黏度、渗透压等皆最小（制备或沉淀蛋白质），在电场中不移动（分离蛋白质）。,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI,在不同的pH环境下，蛋白质的电化学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,在不同的pH环境下，蛋白质的电化学性

23、质不同。,电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。,例 题,根据蛋白质等电点，指出下列蛋白质在所指定的pH条件下，电泳时的泳动方向：(1)胃蛋白酶(pI1.0)，在pH5.0；带负电，向正极泳动(2)血清清蛋白(pI4.9)，在pH6.0；带负电，向正极泳动(3)-脂蛋白(pI5.8)，在pH5.0和pH9.0；在pH5.0时带正电，向负极泳动；在pH9.0带负电，向正极泳动,例 题根据蛋白质等电点，指出下列蛋白质在所指定的pH条件下，,2 蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子，分子量可自

24、1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。因此，它在水中能够形成胶体溶液。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,2 蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子，分子量可自1万至1,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,水化膜,带负电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒,脱水作用,脱水作用,脱水作用,溶液中蛋白质的聚沉,+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,3 蛋白

25、质的沉淀作用,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,3 蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、,蛋白质的沉淀作用,根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变（加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层）时，蛋白质的胶体溶液就不再稳定并将发生沉淀作用(Precipitation)。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。,蛋白质的沉淀作用根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变（,3 蛋白质的沉淀作用,（1）可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使

26、蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。,3 蛋白质的沉淀作用（1）可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶,因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水,3 蛋白质的沉淀作用,（2）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，蛋白质发生沉淀

27、后不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，不易再溶于强酸和强碱中，不能用透析等方法除去沉淀剂后使蛋白质重新溶于原来的溶液中。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,3 蛋白质的沉淀作用（2）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，蛋白,使蛋白质沉淀的试剂：,1.高浓度中性盐：（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 这种加入盐中和蛋白质的电荷，使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。2.有机溶剂：丙酮、乙醇 破坏蛋白质水膜3.重金属盐

28、：Hg2+、Ag+、Pb+与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐4.生物碱试剂：苦味酸、三氯乙酸、目酸、钨酸等 与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐,使蛋白质沉淀的试剂：1.高浓度中性盐：（NH4)2SO4、N,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的变性(denaturation)：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，引起其理化性质改变并导致其生物活性丧失的现象。,4、蛋白质的变性,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。4、蛋白质的变性,变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,造成变性的因素热、紫外光、乙醇等有机溶剂、

29、激烈的搅拌、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级,蛋白质变性后的性质改变：变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。溶解度降低粘度增加结晶能力消失生物活性丧失易受蛋白酶水解,蛋白质变性后的性质改变：,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。豆腐的制作急救：中毒后灌豆浆、牛奶等煮熟食物方便消化防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,应用举例,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，

30、称为复性(renaturation)。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,天然状态，有催化活性尿素、去除尿素、非折叠状态，无活性,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5 蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。5 蛋,6、蛋白质的颜色反应,6、蛋白质的颜色反应,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到

31、纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,二、蛋白质分离和纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。二,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提酸性蛋白用稀碱性溶液抽提脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成品加工：测定蛋白质的

32、性质并干燥成成品。,1蛋白质的分离步骤,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融,沉淀法膜分离法萃取法层析法电泳法,2蛋白质的纯化方法,沉淀法2蛋白质的纯化方法,*盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。阴离子化合物的效果是：NH4+K+Na+阳离子化合物的效果是：PO43-SO42-Cl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。,(1)沉淀法,盐析,2蛋白质的纯化方法,*盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表

33、,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。,(1)沉淀法有机溶剂沉淀法,2蛋白质的纯化方法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂,(1)沉淀法等电点沉淀法,蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH

34、 的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质,2蛋白质的纯化方法,(1)沉淀法等电点沉淀法蛋白质分子在等电点时，净电荷为零,（2）膜分离法 透析法,Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。,2蛋白质的纯化方法,（2）膜分离法 透析法Dialysis此法是利用蛋白质,2蛋白质的纯化方法,透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。

35、,（2）膜分离法,透析法,2蛋白质的纯化方法透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制,2蛋白质的纯化方法,超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。超滤膜的截止分子量有100万、50万、30万、10万、5万、1万、5千和1千（道尔顿，Dr）,（2）膜分离法,超过滤法,2蛋白质的纯化方法超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压,2蛋白质的纯化方法,超过滤法,2蛋白质的纯化方法超过滤法,2蛋白质的纯化方法,两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被

36、萃取。目前主要采用两种体系聚乙二醇-葡聚糖聚乙二醇-磷酸钾,（3）萃取法,双水相萃取法,2蛋白质的纯化方法两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种,2蛋白质的纯化方法,由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。,（3）萃取法,反相胶束萃取法,2蛋白质的纯化方法由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用,2蛋白质的纯化方法,最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力下，CO2处于液体状态，温度为31.1C，当压力或温度发生改变时，CO2处于气液中间态，具

37、有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。,（3）萃取法,超临界流体萃取法,2蛋白质的纯化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力,2蛋白质的纯化方法,（3）萃取法,超临界流体萃取法,2蛋白质的纯化方法（3）萃取法超临界流体萃取法,2蛋白质的纯化方法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度

38、洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,（4）层析法,离子交换层析法,2蛋白质的纯化方法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，,2蛋白质的纯化方法,（4）层析法,离子交换层析法,2蛋白质的纯化方法（4）层析法离子交换层析法,2蛋白质的纯化方法,此法又称为分子筛层析、分子排阻层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400,（4）层析法,凝胶过滤

39、法,2蛋白质的纯化方法此法又称为分子筛层析、分子排阻层析。凝胶,2蛋白质的纯化方法,（4）层析法,凝胶过滤法,2蛋白质的纯化方法（4）层析法凝胶过滤法,蛋白质的空间结构,蛋白质的空间结构,2蛋白质的纯化方法,利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose,（4）层析法,疏水层析,2蛋白质的纯化方法利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小,2蛋白质的

40、纯化方法,这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,（4）层析法,亲和层析法,2蛋白质的纯化方法这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是,2蛋白质的纯化方法,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂

41、糖凝胶等。,（4）层析法,亲和层析法,2蛋白质的纯化方法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白,2蛋白质的纯化方法,在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动，从而达到分离各种蛋白质。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。,（5）电泳法,2蛋白质的纯化方法在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性,根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦等。,根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚

42、焦等。,2蛋白质的纯化方法,SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 2比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,（5）电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,2蛋白质的纯化方法SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶

43、电泳,蛋白质的空间结构,2蛋白质的纯化方法,将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。,（5）电泳法,等电聚焦,2蛋白质的纯化方法将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如,3.蛋白质含量的测定,定氮法：灵敏度较低双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/LFolin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较

44、高25g-250g/ml.,3.蛋白质含量的测定定氮法：灵敏度较低,考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 g/ml.,紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260,考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一,4.蛋白质纯度等的测定,纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。,4.蛋白质纯度等的测定纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯,