第十六章抗生素类药物的分析AnalysisofAntibioticdrugs课件.ppt

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1、第十六章 抗生素类药物的分析Analysis of Antibiotic drugs,1,第十六章 抗生素类药物的分析Ana,第一节概述,定义：在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有 特异抑制作用的化学物质的总称。来源:多数抗生素生物合成(发酵)少数化学合成或者半合成,2,第一节概述定义：2,性质复杂：化学纯度低三多：同系物多 异构体多 降解物多活性组份易变异稳定性差,3,性质复杂：3,1、抗生素类药物一般检查项目：鉴别试验:用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素毒性试验:控制药品中的毒性物质无菌试验:检查药品中有无杂菌污染热源试验:控制药品中的致热物质水分测定:控制水分含量溶液澄

2、明度检查:检查不溶性物质溶液pH试验:测定pH降压试验:检查有降压作用的杂质效价测定:有效成分测定,4,1、抗生素类药物一般检查项目：4,2、效价测定,抗生素活性表示方法：效价。效价：每毫升或每毫克含有某种抗生素的有效成分的多少。,抗生素的效价测定方法有:生物学法 物理化学法目前各国药典仍以生物学测定法为主。,青霉素钠：1670单位/毫克庆大霉素：590单位/毫克,5,2、效价测定抗生素活性表示方法：效价。抗生素的效价测定方,(1)生物学测定法 以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准。优点：原理恰好与临床要求一致，更能够确定抗生素效价。灵敏度高，需要样品量较小既适用较纯精制品,也适

3、用于纯度较差的产品已知或新发现抗生素都能应用 同一类型的抗生素,不需要分离,可一次测定它们 的总效价。缺点:操作步骤多，测定时间较长 误差较大,6,(1)生物学测定法6,(2)物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。优点:操作简单、省时、方法准确 具有较高的专属性缺点:对于结构相似的抗生素，测定结果往往只能代表总的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效价，只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时，才能用于效价测定。,7,(2)物理化学测定法7,3、本章内容-内酰胺类:青霉素类 头孢菌素类氨基糖苷类:链霉素庆大霉素四环素类,8,3、本章内容8,一

4、、化学结构与性质 1、化学结构 青霉素类结构,母核:由-内酰胺环和氢化噻唑环组成的双杂环。,6-氨基青霉烷酸（6APA）母核无UV吸收,不稳定,*,*,*,酸性,第二节-内酰胺类抗生素的分析,9,一、化学结构与性质母核:由-内酰胺环和氢化噻唑环组成的双,（青霉素G、苄青霉素）,10,（青霉素G、苄青霉素）10,氨苄西林（氨苄青霉素）,11,氨苄西林（氨苄青霉素）11,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,12,阿莫西林（羟氨苄青霉素）12,头孢菌素类结构,母核:-内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。,不稳定,酸性,*,*,7-氨基头孢菌烷酸（7ACA）母核有UV吸收,13,头孢菌素类结构母核:-内酰胺环和二

5、氢噻嗪环组成的双,头孢氨苄,14,头孢氨苄14,头孢拉定,15,头孢拉定15,头孢羟氨苄,16,头孢羟氨苄16,2、性质 青霉素类和头孢菌素类结构共同特点：具有-内酰胺环。酸性 有羧基，具有酸性 pKa值在2.5-2.8之间 与碱成盐 如：青霉素G钠、青霉素G钾等,17,2、性质17,旋光性 有手性碳原子，具有旋光性,3个手性碳原子（C3、C5、C6）,2个手性碳原子（C6、C7）,18,旋光性3个手性碳原子2个手性碳原子18,紫外吸收 青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收 但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区

6、也有吸收。像苄青霉素。头孢菌素类分子中有共轭体系（OCNCC），在260nm处有最大吸收。,19,紫外吸收19,20,20,-内酰胺环的不稳定性 干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定，不稳定的部分是-内酰胺环。-内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用。,21,-内酰胺环的不稳定性21,22,22,二、鉴别试验,1、羟肟酸铁反应,(-内酰胺类),23,二、鉴别试验1、羟肟酸铁反应(-内酰胺类)23,2、茚三酮反应,24,2、茚三酮反应24,3、双缩脲反应（-内酰胺类）,似肽键,（开环分解）,25,3、双缩脲反应（-内酰胺类）似

7、肽键（开环分解）25,4、与变色酸-硫酸反应（活泼“-CH2-”）,青霉素阿莫西林氨苄西林,26,4、与变色酸-硫酸反应青霉素26,5、与重氮苯磺酸反应（酚羟基）,（偶合）,举例：头孢哌酮,27,5、与重氮苯磺酸反应（酚羟基）（偶合）举例：头孢哌酮27,6、UV法,头孢氨苄 max=262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm=1.301.50,Cu2+,28,6、UV法头孢氨苄 max=262nm青霉素V钠,7、IR法（chp2010版）该类抗生素共有的特征峰：内酰胺环羰基（17501800 cm-1）；仲酰胺的氨基、羰基（3300cm-1，1525 cm-1，1680 cm-1）；羧

8、酸离子（1600 cm-1、1410 cm-1）；取代苯（760 850 cm-1）,29,7、IR法（chp2010版）29,30,30,8、色谱法（1）TLC法（2）HPLC法（chp2010版）,31,8、色谱法31,1、碘量法 原理：青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其在碱性条件下水解生成的降解产物青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量可以计算青霉素的含量。,三、含量测定,32,1、碘量法 三、含量测定32,方法：以“青霉素钠”为例,（1）主试验：,33,方法：（1）主试验：33,（2）空白试验：,空白试验：做法与一般空白不同（加样品,不加碱水解,其他操作同样品）目的：消除样品中预先存在的降

9、解产物（青霉噻唑酸）及其他耗碘杂质的影响,34,（2）空白试验：空白试验：做法与一般空白不同（加样品,不加碱,2、HPLC法（chp2010）,特点：快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,35,2、HPLC法（chp2010）特点：快速、高效、灵敏35,头孢呋辛酯,例,36,头孢呋辛酯例36,第三节 氨基糖苷类抗生素的分析,一、化学结构及性质（一）链霉素 1、结构,37,第三节 氨基糖苷类抗生素的分析一、化学结构及性质37,38,链霉素38,2、性质：（1）三个碱性中心：2个强碱性胍基（PKa=11.5）1个甲胺基（PKa=7.7）可与矿酸或有机酸成盐（硫酸盐）（

10、2）链霉素在酸性或碱性条件下可变为链 霉胍和链霉双糖胺,39,2、性质：39,（二）庆大霉素 1、结构,40,（二）庆大霉素40,2、性质：（1）五个碱性中心 可与矿酸或有机酸成盐（2）无UV吸收，（因为无共轭系统）,41,2、性质：41,二、鉴别试验（一）共同反应 1、茚三酮反应 氨基糖苷结构，具羟基胺类和-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。,42,二、鉴别试验42,2、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应。,43,2、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）4,3、Molisch试验 该类药物酸水解后，在盐酸（硫酸）作用

11、下脱水成糠醛或羟甲基糠醛，遇-萘酚或蒽酮显色。,44,3、Molisch试验44,4、SO42-反应,H+,5、TLC法6、IR法7、UV法8、HPLC法,45,4、SO42-反应H+5、TLC法45,（二）链霉素的特征反应1、麦芽酚反应：链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。,46,（二）链霉素的特征反应46,47,47,2、坂口反应（链霉胍特有反应）,48,2、坂口反应（链霉胍特有反应）48,1.微生物检定法：本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接

12、种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,三、含量测定（链霉素、庆大霉素）,2.衍生化HPLC法：选用OPA为荧光衍生化试剂。（2005版）3.直接HPLC法：蒸发光散射检测器（2010版）,49,1.微生物检定法：本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量,第四节 四环素类抗生素的分析,50,第四节 四环素类抗生素的分析50,四环素（TC）tetracycline,51,四环素（TC）tetracycline51,金霉素(CTC)chlortetracycline,52,金霉素(CTC)chlortetracycline,一、化学结构,53,一、化学结构53,54,A环B环C

13、环D环二甲氨基N(CH3)2酚羟基酰胺基CON,二、性质,1、呈两性：弱酸性酚羟基、烯醇型羟基 弱碱性二甲胺基 所以遇酸或碱均可成盐,55,二、性质 1、呈两性：55,2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5%加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分。,56,2、含结晶水56,3、溶解度：游离体在水中溶解度很小，溶解度与pH有关。pH4.5-7.2难溶于水,pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.,57,3、溶解度：57,4稳定性：对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快变深形成色素，干燥品较

14、稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。,58,4稳定性：58,三化学反应：1.差向异构化反应：（差向四环素）弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。差向化速度的影响因素：pH9时，差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加，差向化速度增大。,59,三化学反应：59,60,60,2.酸性下降解反应:（脱水四环素类）在酸性（pH2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类。四环素、土霉素和金霉素可发生脱水；强力霉素不发生（C6无OH）。,61,2.酸性

15、下降解反应:（脱水四环素类）61,62,62,3.碱性下降解反应：（异四环素类）在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。强力霉素不发生反应，因C6无OH。,63,3.碱性下降解反应：（异四环素类）63,4.与金属离子络合：能与许多金属离子（锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+，铈Ce4+,钴Co2+）形成有色络合物。,64,4.与金属离子络合：64,四鉴别试验 1.与浓硫酸反应：,65,四鉴别试验65,2.FeCl3反应：,66,2.FeCl3反应：66,3荧光反应：四环素类

16、在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。,67,3荧光反应：67,4、HPLC法5、TLC法6、IR法7、UV法,68,4、HPLC法68,五杂质检查：(一)有关物质 降解产物及异构杂质,会造成药品质量下降。可引起恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿及酸中毒，称为Fanconi症侯群。,69,五杂质检查：69,引起毒性反应的主要物质为差向异构体、脱水物、差向脱水物质，统称为有关物质。ChP2010采用HPLC法检查。脱水物和差向脱水物含量越高，其吸收度越大，因此，ChP还规定杂质的吸收度的限量。,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,70,

17、引起毒性反应的主要物质为差向异构体、脱水物、差向脱水物质，统,（二）杂质吸收度,盐酸四环素max=268nm max=355nm,71,（二）杂质吸收度盐酸四环素max=268nm,72,72,系统适用性试验 1.防护柱2.预试溶液 4-差向脱水四环素 四环素3.RSD2.0%,六、含量测定-HPLC法（外标法）,73,系统适用性试验 六、含量测定-HPLC法（外标,第五节 抗生素药物中高分子杂质的检查,1、为何要进行抗生素中高分子杂质的检查？抗生素是临床用量最大和较易发生不良反应的药物。其中最常见的一类不良反应就是过敏反应。多年来的研究已证明，在内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应中，药物分子

18、本身只是半抗原，药物中存在的高分子杂质才是引发速发型过敏反应的真正过敏原，因此严格控制抗生素中高分子杂质的含量有着重要的意义。,74,第五节 抗生素药物中高分子杂质的检查1、为何要进行抗生素中高,2、高分子聚合物的分类 抗生素中的高分子杂质系指药品中分子量大于药物本身的杂质总称，其分子量一般在10005000Da，个别可达10000Da左右。内酰胺类抗生素中的高分子杂质按其来源通常被分为两类：外源性杂质和内源性杂质。外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物，来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑多肽等。内源性杂质是指抗菌药物的自身聚合产物，聚合物既可来自生产过程

19、，又可在储存中形成，甚至在用药时也可产生。对于现在的生产工艺，外源性的高分子杂质已经较少产生，对内源性聚合物的控制是当前抗生素高分子杂质质量控制的重点。,75,2、高分子聚合物的分类 抗生素中的高分子杂质系指药,3.高分子杂质的控制方法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。药物分子进入凝胶孔径内部，保留时间较长。而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短。根据-内酰胺类抗生素和其高分子杂质的分子量，选用Sephadex G-10 作为-内酰胺类抗生素高分子杂质分离色谱系统的凝胶介质。Sephadex G-10排阻分子量在100

20、0道尔顿左右。根据-内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定-内酰胺类抗生素中的聚合物。此方法已经载入中国药典2000-2010年版，用于国产-内酰胺类抗生素的质量控制。,76,3.高分子杂质的控制方法 76,采用两种流动相：流动相A-pH=7.0的磷酸盐缓冲液，流动相B-纯化水或0.1十二烷基硫酸钠；凝胶介质：Sephadex G-10；检测波长254nm；采用流动相A：除部分寡聚物外，内酰胺类抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，其Kav0。采用流动相B：内酰胺类抗生素可以形成缔合物，导致其表

21、观分子量增大；此时在Sephadex G-10凝胶色谱系统中药物和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在Kav0处表现为单一的色谱峰。利用此原理，在Sephadex G-10凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；再改变色谱条件，测定样品中的高分子杂质和药物分离后在Kav0处的峰响应指标；进行计算，即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。,77,采用两种流动相：流动相A-pH=7.0的磷酸盐缓冲液，流动,属于-内酰胺类的抗生素药物有 A.青霉素 B.红霉素 C.头孢菌素 D.庆大霉素 E.四环素,练习题,78,属于-内酰胺类的抗生素药物有练习题78,以下反

22、应可适用的药物A.青霉素 B.链霉素 C.两者均能 D.两者均不能 1Kober反应 2.羟肟酸铁反应 3.坂口反应 4.N甲基葡萄糖胺反应 5.在酸性溶液中水解,D,A,B,B,C,79,以下反应可适用的药物DABBC79,可以鉴别的药物是 A.链霉素 B.庆大霉素 C.两者均可 D.两者均不可 1.用Kober反应 2.用坂口反应 3.用麦芽酚反应 4.用三氯化铁反应,D,A,A,D,80,可以鉴别的药物是DAAD80,四环素在酸性条件下的降解产物是A.差向四环素 B.脱水四环素C.异四环素 D.去甲四环素E.去甲氧四环素,81,四环素在酸性条件下的降解产物是81,82,82,83,83,B,D,C,E,84,BDCE84,85,85,