第五章核酸的分离纯化课件.ppt
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1、第五章 核酸的分离纯化,温州医学院 彭 颖,第五章 核酸的分离纯化温州医学院 彭 颖,DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子,是分子生物学和分子诊断的研究对象DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作,第五章 核酸的分离纯化,DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子,是分子生物学和分子,核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度,第五章 核酸的分离纯化,核酸分离纯化的原则:第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第二节 基因组DNA的分离纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第四节 RNA的分离纯化,第五章 核酸的分离纯化,第一
2、节 核酸分离纯化的设计及原则第二节 基因组DNA的分,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存第,一、材料与方法的选择,(一)材料与方法的选择,(二)选择原则,一、材料与方法的选择(一)材料与方法的选择(二)选择原则,(一)材料与方法的选择,不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案,一、材料与方法的选择,(一)材料与方法的选择 不同的研究
3、目的对核酸的,1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染,保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤,缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏,(二)选择原则,一、材料与方法的选择,(二)选择原则一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,(一)核酸的释放,(二)核酸的分离与纯化,(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤,二、技术路线的设计(一)核酸的释放(二)核酸的分离与纯化(三,(一)核酸的释放,DNA和RNA均位于细胞内(病毒除外),因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。,二、技术路线的设计,(一)核酸的释放 DNA和RNA均位于细,第五章核酸的分离纯化课
4、件,应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时,其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子,(二)核酸的分离与纯化,二、技术路线的设计,应该清除的杂质主要包括:(二)核酸的分离与纯化,(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐,需用70%75%的乙醇洗涤去除,二、技术路线的设计,(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法二、技,三、核酸的鉴定与保存,(一)核酸的鉴
5、定,(二)核酸的保存,三、核酸的鉴定与保存(一)核酸的鉴定(二)核酸的保存,(一)核酸的鉴定,1.浓度鉴定,2.纯度鉴定,3.完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,(一)核酸的鉴定1.浓度鉴定2.纯度鉴定3.完整性鉴定三、核,紫外分光光度法:核酸分子中的碱基具有共轭双键结构,可以吸收紫外线,其最大吸收波长为260nm。,1.浓度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,紫外分光光度法:1.浓度鉴定三、核酸的鉴定,各种碱基的紫外吸收光谱,三、核酸的鉴定与保存,各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法:核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后,本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与
6、溶液中核酸的含量呈正比。,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法:三、核酸的鉴定与保存,EB与DNA的结合,三、核酸的鉴定与保存,EB与DNA的结合三、核酸的鉴定与保存,紫外分光光度法:主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。,2.纯度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,紫外分光光度法:2.纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA(或RNA)20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品:OD260/OD280=1.8 RNA纯品:OD260/OD280=2.
7、0,三、核酸的鉴定与保存,1.DNA或RNA的定量三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法:EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。,三、核酸的鉴定与保存,三、核酸的鉴定与保存,琼脂糖凝胶电泳:以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解,电泳图呈拖尾状,3.完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,琼脂糖凝胶电泳:3.完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存,DNA的降解,三、核酸的鉴定与保存,DNA的降解三、核酸的鉴定与保存,完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大,电泳迁移率低,荧光强度高沉降系数小,电泳迁移率高,荧光强度低,三、核酸的
8、鉴定与保存,完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条三、核酸,28S(或23S)RNA的荧光强度一般约为18S(或16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带,提示可能存在DNA的污染,三、核酸的鉴定与保存,三、核酸的鉴定与保存,三、核酸的鉴定与保存,三、核酸的鉴定与保存,(二)核酸的保存,1.DNA的储存,2.RNA的储存,三、核酸的鉴定与保存,(二)核酸的保存1.DNA的储存2.RNA的储存三、核酸的,溶于TE缓冲液中的DNA在-70冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时,DNA的脱氨反应减少,pH低7.0时DNA易变性。,1.DNA的保存,(二)核酸的保存,三、核
9、酸的鉴定与保存,溶于TE缓冲液中的DNA在-70冰箱可保存数年。,2.RNA的保存,三、核酸的鉴定与保存,RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中,-70 保存 RNA溶液中加入RNasin或VRC,可延长保存时间 用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理,2.RNA的保存三、核酸的鉴定与保存 RNA溶于H2O,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,五、DNA片段的纯化,六、DNA片
10、段的回收,第二节 真核基因组DNA的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解,一、酚抽提法,1976年由Stafford及其同事创立,现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提,获得DNA粗制品,一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事创立,现在,一、酚抽提法,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法,其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法,但不进行酚的抽提。,二、甲酰胺解聚法 1987年Kupiec等报道了甲,三、玻棒缠绕法,玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上
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