第七章食品中常见病原菌微生物检验技术课件.ppt
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1、,第七章 食品中常见病原微生物检验技术,第七章 食品中常见病原微生物检验技术,我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。致病菌:能够引起人类发病的细菌。对不同的食品和不同的场合,应该选择一定的参考菌群进行检验。,我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌,一、生物学特性 是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌,无芽孢、无荚膜,周身鞭毛,能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。,最适生长温度为35 37,最适pH为7.27.4,较抗寒,能耐受较高盐浓度。,第一节 沙门氏菌检验技术,一、生物学特性 最适生长温度为,不分解乳糖(亚利桑那菌除外)。分解葡萄糖产酸产气(伤寒沙门菌产酸不
2、产气)。多数产生H2S,不产生靛基质,不液化明胶,不分解尿素,不产生乙酰甲基甲醇,多数能利用枸橼酸盐,能还原硝酸盐为亚硝酸盐,在氰化钾培养基上不生长。,沙门菌生物学性状,不分解乳糖(亚利桑那菌除外)。沙门菌生物学,目前至少有67种O抗原和2500个以上血清型,根据其对宿主的致病性,可分为三类,伤寒杆菌副伤寒杆菌(甲、乙、丙),人,肠热症,鼠伤寒杆菌肠炎杆菌 猪霍乱杆菌,儿童伤寒,人、动物,急性胃肠炎,猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌,败血症,沙门氏菌属(Salmonella),目前至少有67种O抗原和2500个以上血清型,根据,二、检验所需器材,二、检验所需器材,三、检验程序,三
3、、检验程序,第七章食品中常见病原菌微生物检验技术课件,沙门氏菌检验程序2010,沙门氏菌检验程序2010,第七章食品中常见病原菌微生物检验技术课件,SN方法:以无菌方式进行多点取样25g+225ml缓冲蛋白胨水,经37水浴4h培养,进行非选择性增菌;确保濒于死亡的细菌进行复活。其后移取10ml转种于盛有100ml四硫磺酸盐煌绿增菌液,经421培养202h,进行选择性的增菌;使目的菌优胜出来。将增菌液摇匀,以无菌操作,分别接种DHL和BS平板上于37培养242h,进行分离培养;使目的菌分离出来。观察每个平板上的菌落,选取3-5个菌落接种于TSI或尿素酶琼脂上,于37中培养242h,进行筛选试验;
4、将符合沙门氏菌特征的TSI中的培养物,接种于营养琼脂平板上,37中培养242h,进行纯化培养;选取单个菌落,接种于20E微量生化管中,进行API生化鉴定;同时取单个菌落,在洁净的玻板上,作血清学鉴定。,SN方法:以无菌方式进行多点取样25g+225ml缓冲蛋白胨,四、操作方法,分五个步骤:1.前增菌2.选择性增菌3.选择性平板分离 4.生化实验5.血清型分型鉴定,四、操作方法分五个步骤:1.前增菌,四、操作方法 分五个步骤:1.前增菌:用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力;BPW2.选择性增菌:使沙门氏菌优势繁殖,其它细菌受到抑制;SC+TTBSC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)TTB(四硫
5、磺酸钠煌绿增菌液)胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长,37适合其他沙门菌生长,42,1824h.为防漏检宜SC+TTB3.选择性平板分离培养:BS+XLD/HE/显色培基4.生化试验:(1)初步生化实验:三糖铁实验(2)对疑似沙门氏菌继续作系统生化实验 最低限度生化实验:靛基质、尿素、KCN、赖氨酸。鉴定分离出来的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱,可采用API 20E 等成套生化试剂5.血清型分型鉴定 A-F多价O血清:把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗体混合起来作成混合血清。位相变异实验原理:在半固体培养基中加入已知相的血清,使解离出的已知相
6、的菌体和血清发生反应,这样已知相的菌体就不能运动了,未知相的菌不能和血清发生反应,能够运动,并被解离出来。血清学鉴定:特异性诊断血清鉴定到种,四、操作方法 分五个步骤:,(一)增菌培养,前增菌称取 25 g(mL)样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中,以 8 000 r/min10 000 r/min 均质 1 min2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样 品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定 pH 值,用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.80.2。无菌操作将样品转至 500
7、 mL 锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于 36 1 培养 8 h 18h。如为冷冻产品,应在 45 以下不超过 15 min,或 2 5 不超过 18 h 解冻。,(一)增菌培养 前增菌称取 25 g(mL)样品放,增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物,移取 1 mL,转种于 10 mL TTB 内,于 42 1 培养 18 h24 h。同时,另取 1 mL,转种于 10 mL SC 内,于 36 1 培养 18 h24 h。,增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物,移取 1 mL,,分离,分别用接种环取增菌液 1 环,划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂 平
8、板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于 36 1 分别培养 18 h24 h(XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板)或 40 h48 h(BS 琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1。,分离分别用接种环取增菌液 1 环,划线接种于一个 BS 琼脂,检测沙门氏菌方法分5个步骤:1.前增菌:在含有营养的非选择性培养基中增菌,使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌恢复其活力。检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态。,检测沙门氏菌方法分5个步骤:,2.选择性增菌
9、,在含选择性抑制剂的培养基中,样品进一步增菌。沙门沙门氏菌检测中增菌的目的是使沙门氏菌以外的细菌(主要是艾希氏菌属)受到抑制,而使沙门氏菌得到一定的增殖,提高沙门氏菌的检出率。,2.选择性增菌 在含选择性抑制剂的培养基中,样品进一步,3.选择性平板分离 划线接种于:BS和XLD琼脂平板或HE琼脂平板各一个,于36+1分别培养1824小时(XLD、HE)或4048小时(BS)。这一步采用固体选择性培养基,抑制非沙门氏菌的生长,提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。,3.选择性平板分离,亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征,亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征,木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂上典型
10、特征,木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂上典型特征,HE琼脂上典型特征,HE琼脂上典型特征,(三)生化试验,挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内,各菌属的主要反应结果如表53。表52说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除,其他的反应结果均有沙门氏菌的可能,同时均有不是沙门氏菌的可能,都需要作进一步的生化试验,必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。,(三)生化试验挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种于三糖铁琼,4.生物化学试验筛选,挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种于三糖铁琼脂培养基中。排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养
11、物菌属的初步鉴定。,4.生物化学试验筛选 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌,TSI(三糖铁)培养基大肠杆菌和沙门氏菌,TSI(三糖铁)培养基,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,沙门菌常用生化试验,尿素酶试验阴性(黄)阳性(红),沙门菌常用生化试验尿素酶试验,靛基质,对照管 阴性()阳性(),靛基质 对照管 阴性()阳性(),第七章食品中常见病原菌微生物检验技术课件,第七章食品中常见病原菌微生物检验技术课件,三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。表2说明,在三糖铁琼脂内斜面产酸,底层产酸,同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其
12、他的反应结果均有沙门氏菌属的可能,同时也均有不是沙门氏菌属的可能。,三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见,2、接种蛋白胨水(供做靛基质试验)尿素琼脂(pH7.2)氰化钾(KCN)将已挑菌落的平板储存于2-5或室温至少保留24h,以备必要时复查。,2、接种,P150(1)A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表可判定为沙门氏菌属。如有2项异常,为非沙门氏菌属。(2)A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。(3)A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸
13、脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。(4)必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。,P150,醇发酵试验,醇发酵试验,阳性(黄)阴性,邻硝基酚半乳糖苷酶试验(ONPG试验),邻硝基酚半乳糖苷酶试验(ONPG试验),邻硝基酚半乳糖苷酶试验(ONPG试验),(1)原理:乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶,因而只能迟缓发酵乳糖,所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。(2)方法:将
14、待试菌接种于ONPG肉汤中,35水浴或孵箱孵育1824h,观察结果。(3)结果:呈现亮黄色为阳性,无色为阴性。(4)应用:可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定,本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性,而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。,邻硝基酚半乳糖苷酶试验(ONPG试验)(1)原理:乳糖,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,接种三糖铁琼脂的同时,还要接种蛋白胨水,pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管,于36+1培养182
15、4小时,必要时可延长至48小时,按表5-3判定结果。沙门氏菌的结果应属于A1、A2和B1,其他五种反应结果均可以排除。反应序号A1,典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常,按表5-4仍可判定为沙门氏菌,如有两项异常,则按A3判定为枸橼酸杆菌。,接种三糖铁琼脂的同时,还要接种蛋白胨水,pH7.2尿素琼脂、,5.血清学分型鉴定,提供培养物菌种的鉴定。用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。1)抗原的准备2)O抗原的鉴定 用AF多价O血清做玻片凝集试验,以生理盐水做对照。3)H抗原的鉴定 4)Vi抗原的鉴定,5.血清学分型鉴定 提供培养物菌种的鉴
16、定。,(五)菌型的判定和结果报告,综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果,按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型,并报告结果。若结果为阴性,则报告为“未发现沙门氏菌”。目前,对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认,其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱即可应用于沙门氏菌的快速检验。我国在这方面也取得一定的进展,如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法,酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点,还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段,有待于我们去研究探讨,以便更好服务于实践。,(五)菌型的判定和结果报告
17、综合以上生化试验和血清学分型鉴定,指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄+H2S黑色有金属光泽、棕褐或灰色,周围培基黑或棕色,或不产硫化氢而呈灰绿色DHL乳糖+H2S乳糖(+):粉红色,(-):无色半透明无色半透明,产硫化氢者中心黑色SS乳糖+H2SHE乳糖+H2S乳糖(+):黄色,(-):蓝色蓝绿色或蓝色,产硫化氢者中心黑色,指示系统指示效果及可疑菌落特点,沙门氏菌检测 概述,原理:沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,一般无荚膜,周生鞭毛(鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌除外)。兼性厌氧,最适生长温度37。在普通显微镜下和在普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分。但沙门氏菌不发酵乳糖,在肠道菌鉴别培养基上
18、形成无色透明菌落,而易与大肠杆菌区别。沙门氏菌有着复杂的抗原构造,一般分为菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和毒力(Vi)抗原三种。沙门氏菌属包括2000个以上血清型,但多数国家从人体、动物和食品中经常分离到有4050种血清型。致病性中毒现象,沙门氏菌检测 概述原,沙门氏菌检测 检测方法,GB前增菌,用无选择性的培养基使处以濒死状态的沙门氏菌恢复活力选择性增菌,使沙门氏菌得以繁殖,而大多数的其他细菌受到抑制选择性平板分离沙门氏菌生化试验,鉴定到属血清学分类型鉴定。,沙门氏菌检测 检测方,沙门氏菌检测 注意事项,结果记录现象观察:菌落特征、革兰氏染色、BS琼脂、HE琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂常见问题
19、:,沙门氏菌检测 注意事,SC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液)MM亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长,37适合其他沙门菌生长,42,1824h为防漏检宜SC+TTB/MM,SC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液,沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征,沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征,第二节 金黄色葡萄球菌检验技术,金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,近年来,美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题,在美
20、国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占45%,我国每年发生的此类中毒事件也非常多。,金黄色葡萄球菌的流行病学,近年来,美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起,金黄色葡萄球 葡萄球菌 表皮葡萄球菌 属分类:腐生葡萄球菌,金黄色葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于进食含有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起。常见的菌为金黄色葡萄球菌。,金黄色葡萄球 金黄色,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病,可引发不同程度的急性胃肠炎症状,恶心、呕吐最为突出而且普遍,腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品,如牛奶和奶
21、制品、肉、蛋等,在温度条件适宜时,经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,致病性 葡萄球菌性食物中毒是葡,雪印牛奶中毒事件,2000年6月29日起,日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等3种牛奶制品被查出金黄色葡萄球菌毒素,造成1.5万名消费者中毒 原因是在北海道的奶粉生产工厂(该厂的产品都是先制成奶粉,再在各地工厂还原成牛奶)出现了停电,使生产线上的原料停留过久,所以出现了细菌超标。2001年以后-借助其他公司支援开始分割公司事业。2002年雪印食品被解散,雪印牛奶中毒事件 2000年6月29日起,日本雪印公司奶粉、,一、生物学特性,革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌,为球菌,排列成葡萄状,无芽孢、鞭毛
22、,不运动;大多数无荚膜。最适生长温度37,最适pH为7.4,对热抵抗力较强,8030min才能被杀死。可在10%-15%氯化钠和40%胆汁中生长,一、生物学特性 革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌,为球菌,,生物学特性,好氧生长的细胞产生接触酶;产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶,大多数菌株可水解天然的动物蛋白,例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶,水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质,并释放脂肪酸。所有的毒株产生凝固酶,人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。,生物学特性 好氧生长的细胞产生接触酶;产生蛋,生物学特性-培养特征,大多数菌株产生类胡萝卜素,使细胞团呈现出深橙色到浅黄
23、色,色素的产生取决于生长的条件,而且在单个菌株中可能也有变化 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气。甲基红反应阳性,VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶。具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感。,生物学特性-培养特征,致病性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌,临床表现多种多样,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、胃肠炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。,致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最,致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶:a.溶血毒素:外毒素,分甲、乙、丙、丁、戊五种,能损伤血小板,破坏溶酶
24、体,引起肌体局部缺血和坏死;b.杀白细胞素:可破坏人的白细胞和巨噬细胞;c.血浆凝固酶:侵入人体时,该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关;d.脱氧核糖核酸酶:产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温,可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌;e.肠毒素:产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素,现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有A、B、C1C3、D、E、G、H共9种。肠毒素A是最常见的。,金黄色葡萄球菌的致病性,致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶:金黄色葡萄,葡萄球菌皮肤感染,葡萄球菌皮肤感染,食物中毒症状及发生原因:,症状,原因,食物中毒
25、症状及发生原因:症状原因 恶心、反复呕吐,二、检验所需培养基,10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 7.5%氯化钠肉汤血琼脂平板Baird-Parker 琼脂平板脑心浸出液肉汤(BHI)兔血浆磷酸盐缓冲液营养琼脂小斜面革兰氏染色液无菌生理盐水,二、检验所需培养基10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,三、检验程序,GB 4789.10-2010标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。,三、检验程序GB 4789.10-2010标准,第一法,第一法,检样,25g样品+2
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