第十章园艺植物遗传转化ppt课件.ppt

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1、第十章 园艺植物遗传转化,园艺植物遗传转化受体系统；园艺植物遗传转化方法；园艺植物转化植株的鉴定；提高处外源基因在园艺植物体内表达水平的策略；基因沉默技术与基因剔除技术；外源基因在园艺植物中的遗传,植物遗传转化(plant genetic transformation),定义:是应用分子重组技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术,有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中,并使其在后代植株中得以表达的过程.目的:提高产量,品质和抗性,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,植物遗传转化受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源

2、DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,一、遗传转化对园艺植物受体系统的要求高效稳定的再生能力 用于园艺植物遗传转化的外植物体必须易于再生，不仅再生频率要高，而且稳定性和重复性要好。高效的再生频率很大程度上决定着植物基因的转化频率。(2)较高的遗传稳定性 园艺植物遗传转化是有目的地将外源基因导入植物并使其整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物的遗传物质、改造不良农艺性状的目的。这就要求植物受体系统在接受外源DNA后应稳定遗传后代。无性系的变异与组织培养的方法、再生途径及外植体的基型都有密切关系。,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,(3)稳定的外植体来源

3、遗传转化的频率低，需要反复的实验，所以要建立一个高产的组织培养再生系统并能用于遗传转化，需要大量的、稳定的外植体作为材料。转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用可进行快速繁殖的材料,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,(4)对抗生素的敏感性 为了抑制农杆菌的过度生长而产生污染，选择、筛选转化的细胞核植株，在遗传转化中常使用两类抗生素：1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如卡那霉素、潮霉素2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时间后用于抑制农杆菌的生长，防止细菌过度生长而产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如氨

4、苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素等,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,(5)对农杆菌侵染的敏感性 1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的天然寄主，否则难以实现遗传转化 2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作为受体系统,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,二、常用的园艺植物受体系统 自从20世纪70年代以来，对园艺植物基因转化受体系统进行了大量的研究工

5、作，先后建立了多种有效的受体系统，适用于不同转化方法的要求和不同的转化目的，如1、组织受体系统2、原生质体受体系统3、生殖细胞受体系统,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,（1）组织受体系统 定义：利用园艺植物的叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体培养获得再生植株的受体系统为组织受体系统。组织受体系统是园艺植物遗传转化适用最多的受体系统，目前已成功建立的组织受体系统有百合花器、地上茎、茎尖、叶片、鳞片叶、珠芽，菊花叶片，葡萄叶片，下胚轴，柑橘成年茎段，马铃薯试管薯切片，试管苗茎段，生菜叶盘，辣椒下胚轴等。,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,按照获得再生植株的途径，组织受体系统一般包括：a）愈伤组织再生

6、系统：指外植体经过脱分化形成愈伤组织，再分化获得再生植株优点：转化率高、外植体来源容易、转化植株易扩繁、适用广泛等；缺点：外源基因遗传稳定性差、嵌合体多；,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,b）直接分化再生系统：不经过愈伤组织阶段，直接分化出不定芽获得再生植株；优点：操作简单、体细胞无性系变异小等缺点：转化率低、嵌合体多,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,（2）原生质体受体系统原生质体转化受体系统的优点：a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传物质b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性c）原生质体转化受体系统易于

7、在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和嵌合d）适用于各种转化系统,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,原生质体转化受体系统的局限性：a）原生质体培养周期长、难度大、再生频率低b）许多园艺植物原生质体培养的技术尚未成熟,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,（3）生殖细胞受体系统 定义：利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统，也称为种质系统。,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,利用生殖细胞进行遗传转化，主要有两种途径：1）利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建

8、立单倍体的基因转化受体系统2）直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房注射法等,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,与其他受体系统相比生殖受体系统具有以下优点：1）以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能2）受体细胞是单倍体细胞，转化的细胞无显隐性的影响，能是基因充分表达，有利于性状的选育。单倍体植株通过加倍后即可成为纯和的二倍体纯系，大大缩短了复杂的选育纯化的过程3）利用植物自身的授粉过程进行遗传转化，操作方便、简单。局限性：生殖受体系统受季节限制，只能在短暂的开花期进行。,第二节 园艺植物遗传转化方法,园艺植物的遗传转化方法大体

9、上分为3类：1）外源裸露基因的直接导入法：指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物基因组中，其中物理方法包括：电穿孔转化法、基因枪转化法、激光微束空孔转化法、体内注射法、超声波法等；化学方法包括：PEG和脂质体介导转化法等；2）载体介导的转化法：指通过将目的基因连接在植物载体上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因中的方法。该方法主要包括农杆菌介导和病毒介导的转化法；3）种质转化系统法，包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,一、外源裸露DNA的转化（一）化学诱导转化法 化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DN

10、A直接导入植物细胞的方法。目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。,第二节 园艺植物遗传转化方法,1、转化原理（1）特性：PEG是一种水溶性的细胞融合剂和渗透剂，相对分子质量为15006000，pH4.64.8，因聚合程度不同而异。（2）转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性，诱导原生质体摄取外源基因DNA。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（3）干扰因素：PEG浓度、分子大小、二价阳离子、溶液pH大小 在二价阳离子如磷

11、酸钙的公共作用下，PEG能使外源DNA沉积在原生质体膜表面，并促进细胞对沉积的DNA进行主动吸收，从而加快实现外源DNA进入受体细胞；高pH也可诱导外源DNA分子的吸收，因而PEG介导转化时常将溶液pH调到8.0左右。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2、转化的基本步骤及其应用PEG介导的遗传转化一般包含以下步骤：a）外源目的基因的制备b）原生质体制备c）目的基因和原生质体的转化培养d）转化体的鉴定和再生植物的培养目前PEG介导的遗传转化法在花椰菜、胡萝卜、向日葵、卡特兰、柑橘等园艺植物上均有成功的报道。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3、优缺点1）PEG介导遗传转化方法的优点：a）操纵简单、成

12、本低，无需昂贵的仪器设备；b）可同时操作多个样品，获得高存活率和分化率的转化细胞；c）DNA直接导入可用于对基因的瞬时表达进行快速分析；克服了农杆菌介导转化对受体植物范围的限制；d）建立了原生质体再生体系的植物和组织都可适用，其结果比较稳定，重复性好。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2）PEG介导遗传转化方法的缺点：由于建立植物原生质体再生体系比较困难，加之PEG对原生质体活力的有害作用，因此转化率低，一般为10-510-3。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（二）电穿孔转化法 电穿孔转化法，又称电击法或“电注射法”。Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat基因导入玉米原生质体。电穿

13、孔转化法可用于原生质体的瞬时和稳定转化，也可用于带壁的植物细胞的遗传转化。,第二节 园艺植物遗传转化方法,1、转化原理1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4mm左右，每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入；2）电穿孔法分为两类：高压短时程法 低压长时程法选择何种方法应依据细胞种类和实验条件而定。一般用低压长时程法可以使其达到较快的修复，从而得到较多的瞬时表达产物。不过，高压短时程法可以得到较高的DNA整合率。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2、操作程序及其应用电穿孔法一般操作程序：1）制备含目的基因的质粒DNA2）制备植

14、物原生质体悬浮液或一定处理的植物组织3）将质粒DNA和原生质体悬浮液混合后置于200600V/cm的电场中处理若干秒4）原生质体培养和转化子筛选5）再生植物鉴定与培养,第二节 园艺植物遗传转化方法,电穿孔法适用植物细胞和组织转化，在已经知道的众多转化案例中，植物细胞和组织的转化能力依赖于细胞或组织的预处理，如机械损伤、渗透压等，但水稻、玉米、小麦等未成熟胚胎的细胞不经处理也能吸收DNA，目前，经过电穿法成功转化的园艺植物油胡萝卜、芦笋、芜菁、四季豆等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3、优缺点1）电穿孔法的优点：操作简便、转化率较高，特别适合于瞬时表达研究2）电穿孔法的缺点：必须经过原生质体培

15、养、易造成原生质体损伤，使其再生率降低3）若将电穿孔法与PEG转化法。脂质体法和激光微束法等技术结合使用，电穿孔法的转化率可大大提高，最高可达1.2%。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（三）基因枪转化法 基因枪转化法又称微弹轰击法，是植物遗传转化较常用的方法之一，转化率较高，一般为10-310-2，但不同物种组织转化率差异很大，最高的可达2.0%，最差的低于10-4。1、转化原理 基因枪法是利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱动力，将包裹有生物活性DNA的金属小颗粒加速，高速轰击植物组织或细胞，使外源基因实现穿壁并导入受体细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出新的植物类型的技术。,第二节

16、 园艺植物遗传转化方法,2、基本步骤及其应用基因枪遗传转化的基本步骤包括：1）受体细胞或组织的准备和预处理2）DNA微弹的制备3）受体材料的轰击4）轰击后外植体的培养和筛选目前，基因枪法分别在桃、番木瓜、蔓越橘、玫瑰、杜鹃、剑兰、大蒜、生菜、荔枝等园艺植物上成功实现了目的基因的转化,第二节 园艺植物遗传转化方法,3、优缺点基因枪转化法具有下列优点：1）无宿主限制，特别适宜那些由原生质体再生植株较为困难和对农杆菌感染不敏感的单子叶植物，提高了单子叶植物的转化效率；2）操作简单，可控程度高，可以根据实验的需要调控微弹的速度和摄入浓度，命中特定层次的细胞，提高遗传转化效率；3）靶受体类型广泛不受基因

17、型的限制，能转化所有具有分省潜力的植物的任何组织或细胞，包括原生质体、根、叶以及种子的胚、子叶、分生组织、愈伤组织、花粉、子房等；,第二节 园艺植物遗传转化方法,4）可将外源基因导入线粒体、叶绿体等植物细胞的细胞器，重复性好，获得外源基因能稳定表达的转基因株系，这是目前质体转化研究中最常用和最有效的DNA导入方法。基因枪转化法的局限性：1）相对于农杆菌介导的遗传转化相比，基因枪转化法因轰击的随机性导致转化的效率较低2）成本低,第二节 园艺植物遗传转化方法,3）出现非转化体和嵌合体的比率大；4）基因插入往往是多拷贝随机整合到受体基因组中，可能发生所种方式的重拍，也可能会因为与植物本身序列同源而相

18、互作用，导致转录或转录后水平的基因沉默，因而遗传稳定性差；5）轰击过程中可能造成外源基因的断裂，使插入的基因成为无活性的片段等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（四）激光微束穿孔转化法1.转化原理 激光微束穿孔法又叫显微激光法，指将激光聚焦成微米级的微束照射细胞或组织后，利用其热损伤效应时使细胞壁上产生可逆性的小孔，使加入到细胞培养基里的外源基因进入植物细胞，从而实现基因的转化。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2.基本步骤及其应用激光微束穿孔转化法基本步骤如下：1）含目的基因质粒DNA的制备；2）植物外植体材料的选取及高渗预处理3）预处理外植体和质粒DNA混合并注入小室，然后用激光微束仪照射，

19、照射时使用波长为0.35m，脉宽1015ns，输出能量大于2mJ，60008000脉冲；4）转化子筛选、培养及转基因植株鉴定。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3、优缺点优点：激光微束穿孔转化法具有操作简单、适用性广、无宿主范围限制、能转化细胞器等特点缺点：所需仪器昂贵，转化效率较低 激光微束穿孔转化法最早用于大田作物，如水稻、小麦、玉米、油菜、棉花等，现已成功地应用于百脉根、马铃薯、兰花等园艺植物的遗传转化。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（五）体内注射转化法1.转化原理 体内注射转化法利用一定的注射器将外源基因直接注入到已固定的植物细胞或组织中，从而实现基因转移、获得转基因再生植株的技术，包

20、括显微注射法和直接注射法。显微注射法注射部位多是植物受体细胞的细胞核或细胞质，直接注射法所用外源DNA量大，注射部位则可以是子房、穗基、分蘖节等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2、基本步骤及其应用体内注射的基本操作步骤：1）制备具有良好表达活性的目的基因；2）受体细胞或组织的固定；3）通过体内注射导入已规定的受体细胞或组织；4）转化子筛选、培养及转基因植株鉴定显微注射的一个重要环节是固定受体细胞。目前，人工固定的方法主要有3种：琼脂糖包埋法、多聚-L-赖氨酸黏连法、吸管支持法。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3、优缺点体内注射法的优点：1）可控制DNA注射量，并可对多种组织（如小孢子、胚前合

21、子等）进行注射；2）转化率较高，整个操作过程对受体细胞无毒害作用，有利于转化细胞的生长发育。,第二节 园艺植物遗传转化方法,体内注射的局限性：1）每次只能对一个细胞或组织进行操作，因而操作繁琐耗时，工作效率低；2）注射时可能刺伤受体细胞；3）外源DNA整合多为多拷贝，易引起整合部位的突变4）此种方法需以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术，否则很难获得稳定表达的细胞克隆及转基因植株。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（六）脂质体介导转化法1.转化原理 脂质体法是根据生物膜的结构和功能特性，人工用脂类如磷脂等化合物合成的双层膜囊包装外源DNA分子或RN

22、A分子，导入原生质体或细胞，以实现遗传转化的技术,第二节 园艺植物遗传转化方法,2.基本步骤及其应用脂质体法有两种具体方法：1）脂质体融合法：先将脂质体与原生质体共培养，使脂质体与原生质体膜融合，而后通过下拨的内吞作用把脂质体内的外源DNA或RNA分子高效地转入植物的原生质体内。最后通过原生质体培养技术，再生新的植株；2）脂质体注射法：通过显微注射把含有遗传位置的脂质体注射到植物细胞以获得转化。,第二节 园艺植物遗传转化方法,脂质体即可包裹小分子离子、螯合剂、糖类、药剂，也可包裹大分子物质，如蛋白质、RNA、YAC，甚至染色体，多用于动物材料的转移。在园艺植物上，最早研究发现带电脂质小泡能被番

23、茄原生质体吸收。Mattews等通过脂质体法先后实现了细菌RNA和DNA向胡萝卜原生质体的转移。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3.优缺点脂质体法的优点很多，具体有：1）保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应2）适用的植物种类广泛，重复性高，操作简单，转化率较高。脂质体法的缺点：脂质体转化率低，需要完善的原生质体培养及植株再生技术体系支持,第二节 园艺植物遗传转化方法,二、载体介导的DNA转化 载体介导的DNA转化有农杆菌介导法和植物病毒介导法如花椰菜花叶病毒（CaMV）和番茄金花叶病毒（TGMV）。由于病毒可引起破坏性的侵染，需要严格保护，防止载体从寄主中逃逸侵

24、染自然中的植物，因此，CaMV和TGMV作为克隆载体尚需进一步的改造。本节仅介绍农杆菌介导的遗传转化方法。农杆菌属是普通存在于土壤中的一种革兰氏阴性植物细菌，目前作为遗传工程载体分农杆菌分为根癌农杆菌和发根农杆菌。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（一）根癌农杆菌介导的遗传转化1.转化原理 根癌农杆菌在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，诱导植物产生冠瘿瘤并合成冠瘿碱，为其生长发育和繁殖提供碳源、氮源和能源，干扰被侵染植物的生长。根癌农杆菌细胞中的Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，相对分子质量为9.51071.6108。,第二节 园艺植物遗传转化方法,通过转座子插入突变和缺失图谱分析

25、可将Ti质粒分为以下4个功能区域：1）T-DNA区（transferred DNA region，转移-DNA区）长度为1530kb，是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移并整合到植物基因组中的一段DNA。胭脂碱性的T-DNA是15kb长的DNA连续片段，占Ti的7%15%，T-DNA的左边界和右边界是长为25bp的末端反复重复序列。,第二节 园艺植物遗传转化方法,在胭脂碱和章鱼碱的T-DNA区段中，至少存在着4个有转录活性的可读框，分别是：a）编码章鱼碱合成酶，又叫羧乙基赖氨酸脱氢酶基（ocs），它位于TL-DNA的右端。具有真核特性的启动子，但它不存在间隔子，且在靠近3端处有一

26、段真核的多聚腺苷酸化信号；b）细胞分裂素生物合成酶的编码基因（tmr），当其发生突变时会激发冠瘿瘤出现大量的增生，所以又叫根性肿瘤基因。它编码的异戊烯转移酶，能催化玉米型细胞分裂素的合成；,第二节 园艺植物遗传转化方法,c）参与控制植物生长素合成的基因tms，它分为tms1和tms2，分别编码色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺水解酶；d）大肿瘤基因tm1的转录本6a和6b以及转录本5的转译产物则是以非激素的方式抑制自身细胞的分化，因此形成大型的冠瘿瘤。tmr突基因的突变和失活，会导致植物生长素产量的增加和细胞分裂素产量的下降，结果有利于根的形成；而tms1和tms2基因的突变或失活，会导致细胞分裂

27、素产量的增加和植物生长素产量的下降，从而有利于芽的形成。Tmr、tms1和tms2基因统称为致瘤onc基因或onc区段。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2）Vir区：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区，又叫毒性基因或Vir基因或致病基因。3）Con区：该区段上存在着与细菌间结合转移相关的基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌指甲的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为结合转移编码区。4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始，故称为复制起始区（点）。,第二节 园艺植物遗传转化方法,根癌农杆菌Ti质粒遗传转化大致可以分为以下步骤：1）

28、农杆菌识别并附着到植物细胞上2）这些特异性的植物信号分子被农杆菌Ti质粒上的由VirA/VirG组成的双组分信号转导系统所识别；3）经过信号转导诱导Ti质粒上Vir区基因的表达；4）VirD1和VirD2蛋白共同作用，切割T-DNA的左右边界，产生一条单链T-DNA分子（T链）；5）在农杆菌细胞中，1分子VirD2蛋白共价结合到T链的5端，形成ssDNA-蛋白复合体（未成熟T复合体），然后和几个别的Vir蛋白一起，通过VirB/D4 型分泌系统（T4SS通道）进入植物细胞的细胞质,第二节 园艺植物遗传转化方法,6）此时，未成熟T复合体受到许多VirE2分子的包裹和保护，形成成熟的T复合体，并通

29、过植物细胞的细胞质向细胞和运输；7）在VirD2和E2蛋白的核定位信号识别下，成熟T-DNA复合体通过细胞核核孔进入植物细胞细胞核；8）T复合体在细胞核内被运输到整合位点；9）T-DNA解包裹；10）T-DNA整合到植物基因组中。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2.基本步骤及其应用1）先建立的农杆菌Ti质粒介导的植物基因转化方法有：叶盘转化法、原生质体共培养转化法、整株感染法等2）以上转化方法的基本程序包括：a）含重组Ti质粒的工程菌培养及转化；b）选择合适的外植体；c）工程菌与外植体共培养；d）外植体脱菌及筛选培养；e）转化植株再生及鉴定。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3.优缺点优点：1）

30、利用天然载体系统，成功率高，效果好；2）转移的外源基因常为单拷贝整合，很少发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且符合孟德尔遗传定律；3）费用低，方法简单，易于操作；4）与基因枪法结合使用，效果更佳；5）使用寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都可采用此法。,第二节 园艺植物遗传转化方法,缺点：1）农杆菌介导的转化主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物，大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用范围；2）农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来麻烦。,第二节 园艺植物遗传转化方法,（二）发根农杆菌介导的遗传转化 Ri质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物

31、质，与Ti质粒相似，属于巨大质粒，大小为200800kb。Ri质粒与Ti质粒不仅结构、特点相似，而且具有相同的寄主范围和相似的转化原理。与Ri质粒相关的主要为Vir区和T-DNA区两部分。Ri质粒的T-DNA也存在冠瘿碱合成基因，且这些合成基因只能在被侵染的真核细胞中表达。根据Ri质粒诱导的冠瘿碱的不同，Ri质粒可分为3种类型：农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型,第二节 园艺植物遗传转化方法,三、种质转化法 定义：以植物自身种质细胞为媒介，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的技术称为种质转化系统，该技术也称为生物媒体转化系统或整株活体转化。种质转化法已发展成为一种颇具潜力的转化系统。具体的转

32、化方法包括植物原位真空渗入法、花粉管通道法和浸泡转化法等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,种质转化法具有的特点：1）目的DNA可以是裸露的DNA，也可以是总DNA或重组质粒DNA，还可以是某些DNA片段；2）转化过程依靠植物自身的种质系统或细胞结构来实现，不需要细胞分离、组织培养和再生植株等复杂技术；3）方法简便易行，并与常规育种紧密结合,第二节 园艺植物遗传转化方法,（一）植物原位真空渗入法1.转化原理 原理：将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理、造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下发生遗传转化。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2

33、.基本步骤及其应用植物原位真空渗入法的基本步骤：1）培养生长到一定阶段的植物，一般是开始蕾至开花初期；2）制备含目的基因的农杆菌菌液；3）将植物倒置浸泡于农杆菌菌液中，进行真空处理；4）感染植物种植于土壤中，生长发育，直到收获种子；5）种子在选择培养基上发芽，进行抗性筛选，获得转化后代。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3.优缺点植物原位真空渗入法的优点：简便、快捷，实验可靠、成本廉价，不需要进过组织培养阶段即可获得大量转化植株，转化率高；植物原位真空渗入法的缺点：在遗传转化时需要真空装置，真空处理前后植株的拔取和重新栽培增加了工作量；应用范围较窄，需要进一步的开发。,第二节 园艺植物遗传转化方

34、法,（二）花粉管通道转化法 定义：花粉管通道转化法，是周光宇等建立发展起来的，是一种借助于植物自身的生殖卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术。1.转化原理 在植物授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而获得转化植株。,第二节 园艺植物遗传转化方法,2.基本步骤及其应用基本程序包括：1）外源DNA的制备；2）根据受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间及方法；3）将外源DNA导入受体植物；4）转基因植物目标性状的鉴定及分子检测。利用花粉管通道法导入外源基因的方

35、法通常为：花粉粒与外源DNA混合授粉法、花粉粒培养法、柱头滴柱法、花粉粒转化法和微注射法等。,第二节 园艺植物遗传转化方法,3.优缺点优点：1）不依赖于细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，成本低，适宜普及；2）适用于多种单、双子叶植物局限性：1）该种方法只能在开花期才能进行，而且受体植物的受精过程及时间规律难以掌握；2）重复性差、成株转化率相对低，以及外源DNA整合机制不清楚的问题依然存在,第二节 园艺植物遗传转化方法,（三）种子浸泡转化法定义：浸泡转化法指将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA

36、溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。,第二节 园艺植物遗传转化方法,1.转化原理 浸泡转化是利用细胞自身的物质运转系统将外源DNA直接导入受体细胞。将外源DNA吸入植物细胞的途径有：1）通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统可以将外源DNA运输到每个细胞；2）通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内；3）通过传递细胞的膜透性的改变为大分子物质透过细胞提供机会,第二节 园艺植物遗传转化方法,2.基本步骤及其应用浸泡转化法的基本步骤：1）外源DNA的制备；2）具有生活能力种子的获得及浸泡处理；3）在浸泡液中加入外源DNA；4）种子培养、发芽及抗性鉴定。,第二节

37、 园艺植物遗传转化方法,3.优缺点优点：种子浸泡转化法是植物转基因技术中最简单、快捷、便宜的一种转化方法，不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且容易推广普及；局限性：在于转化率低，重复性差，而且筛选和检测也比较困难。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,为了筛选和鉴定携带目的基因并稳定表达的转化植株，已发展处一系列的转化基因植物的筛选和鉴定的方法：1）根据检测的基因功能分为：调控基因（启动子和终止子）、选择表及基因检测、目的基因直接检测法2）根据检测的不同阶段分为：整合水平检测、表达水平检测法,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,3）外源基因整合检测方法为：Sou

38、thern杂交、PCR、PCR-Southern杂交、原位杂交、DNA分子标记技术等4）表达水平的检测方法为：Nourthern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸收法（ELISA）、Western较等,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,一、利用选择标记基因和报告基因鉴定定义：选择标记基因是指在选择压下，编码产物能够使转化细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性，而非转化细胞则不能在施用选择剂的条件下生长、发育和分化的基因。选用选择标记基因有利于在大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,植物基因工程中选择标记基因一般具有4个特征：1）编码一种不存在于正常植物细胞中的产物，

39、如酶和蛋白质；2）基因较小，易构成嵌合基因；3）能在转化体中得到充分的表达；4）容易检测并能定量分析。报告基因是指其编码产物在受体细胞、组织或器官中具有表达活性，能够被快速地测定的一类特殊用途的基因。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（一）抗生素抗性基因鉴定园艺植物遗传转化上常用的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因（npt）和潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。1）npt是卡那霉素抗性基因或氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，是园艺植物转化中运用最广泛的选择标记基因，其编码产物对卡那霉素、庆大霉素的那个具有抗性。卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体蛋白质的合成，会导致植物细胞死亡。常用浓度为5010

40、0g/mL。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,2）hpt基因的表达产物对潮霉素具有抗性，因而在培养基中筛选的抗生素是潮霉素，常用浓度为30100 g/mL NPT活性的检测通常采用点渍法和酶联免疫测定法。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（二）除草剂抗性基因鉴定 植物遗传转化中常使用的除草剂抗性基因有bar、aroA、als和PSbA，其中bar和als最为常用。Bar是编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）基因，该酶能是除草剂Basta（有效成分PPT）失活，从而达到除草剂的目的。因此，在遗传转化筛选培养基中加入相应的选择剂Basta、PPT、或Bialaphos，即可筛选歘转基因植株。als是另

41、一个重要的除草剂抗性基因，该基因编码乙酰乳酸合成酶（ALS），相应选择剂为绿磺隆（CS）或甲尿磺酰甲酯（SM）。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（三）显色或发光基因鉴定作为理想的植物报告基因应具备以下特征：1）编码的产物是唯一的，并且对受体细胞无毒；2）表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞内不存在，即无背景；3）产物表达水平稳定，便于检测等。转基因植物常用的报告基因有-葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因（gus）、胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、荧光素酶基因（luc）和绿光荧光蛋白基（GFP）基因,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,1.gus基因的鉴定 来自大肠杆菌的gus基因

42、是应用较为广泛的报告基因，编码-葡萄糖醛酸乙酰转移酶，能作用于底物产生蓝色沉淀，该反应可用于分光光度法测定，而蓝色沉淀沉积于植物的组织有课直接观察到，因而gus基因表达检测容易、迅速，只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,2.nos和ocs基因的检测目前采用纸电泳法检测nos和ocs基因。电泳后用菲醌染色，菲醌与精氨酸、胭脂碱、章鱼碱作用后在紫外光下显示黄色荧光，放置两天后变为蓝色。3.荧光素酶基因的鉴定荧光素酶基因主要来自于细菌和萤火虫。细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，催化脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子；萤火虫荧光素酶在镁离子、三磷酸腺苷和氧的作用下，与底

43、物作用生成氧化荧光素，同时放出光子，便于检测。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,4.绿色荧光蛋白（GFP）基因的鉴定 与其他选择标记相比，GFP的检测具有不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点。同时，GFP生色基团的形成无种属特异性，在原核和真核生物细胞中都能表达，其表达产物对细胞没有毒素作用，并且不影响细胞的正常生长和功能。所以利用gfp作为选择标记基因，可以很方便地从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株，并且可用来追踪外源基因的分离。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,二、利用重组DNA分子特征鉴定（一）重组DNA分子酶切图谱鉴定 目的基因插入会使表达载体D

44、NA限制性酶切图谱发生变化，提取转化细菌的质粒，DNA酶切后做电泳观察其酶切图谱，即可分析外源基因是否正确插入载体中。（二）PCR技术鉴定 PCR的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物决定的。通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内目的基因的片段，而非转化植株不被扩增。PCR检测易出现假阳性，故常用作初筛，筛选的阳性植株需做Southern杂交进一步验证。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（三）Southern杂交技术鉴定Southern杂交指模板DNA经酶切、凝胶电泳分离、转膜等步骤后，再用标记的单链DNA探针杂交检测的一种技术，其理论基础是碱基互补配对原则。Southern杂交是进

45、行核苷酸序列分析、重组子鉴定和检测外源基因整合及表达情况的强有力手段。该法还可清除操作过程中的DNA污染和转化中的质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高，特异性强，是目前检测转化基因植株最权威的方法。但程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,三、利用外源基因的转录或表达鉴定（一）Northern杂交与点杂交技术鉴定 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过总RNA或mRNA与探针杂交来分析，成为Northern杂交，是研究转基因植株外源基因表达及其调控的重要手段。点杂交是将总RNA提取物经多孔过滤进样器直接转移到杂交膜上，其余步骤与Northern杂交相同。,

46、第三节 园艺植物转化植株的鉴定,Northern杂交的原理：RNA样品经凝胶电泳、转膜、预杂交后，再用标记的探针与膜上的RNA杂交，以检测RNA样品中是否有与探针同源的序列，如果有杂交信号，表明整合到植物染色体上的外源基因能正常表达。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（二）Western杂交技术鉴定Western杂交的基本原理：从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品进行SDS-PAGE，使蛋白质按大小分离，经分离的各种蛋白质条带原位印迹到固相膜上，然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的被标记的二抗，最后通过二抗上的标记化合物进行检测。转

47、化的外源基因表达正常时，转基因植株细胞中会存在一定量的特异蛋白，Western杂交可以有条带信号。,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,（三）蛋白质免疫测定技术鉴定1.酶联免疫法酶联免疫法（ELISA）指特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔上，加入样品，未被结合的成分被洗掉，然后通过加上酶的抗体来检测抗原，未被结合的成分再次被洗掉，酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。在转基因植株中，含有抗体的均可采用此方法进行。2.免疫荧光技术免疫荧光，是以抗体为基础，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微镜进行检测。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,一、转基因园艺

48、植物中外源基因的沉默（一）转基因沉默现象定义：园艺植物遗传转化的目的是获得能高效表达、稳定遗传的转基因株系，但大量的实验表明，导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中出现表达受到抑制，甚至完全不表达的现象，称为转基因沉默。转基因沉默分为：转录水平上的基因沉默（TGS）转录后水平上的基因沉默（PTGS）.,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,(二)引发转基因沉默的因素1.DNA甲基化定义：DNA甲基化是细胞中最常见的一种DNA共价修饰形式，在植物基因表达、细胞分化以及系统发育中起重要的调节作用。研究表明，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。,

49、第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,2.重复序列定义：重复序列诱导的基因沉默（RIGS）指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。重复序列有两种作用方式：1）顺式失活，指相互串联或紧密连锁的重复基因失活；2）反式失活，指由于基因启动子间同源序列相互作用引发的基因失活现象，也指某一基因的失活状态引起同源的等位或非等位基因的失活。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,3.位置效应定义：位置效应是指外源基因在植物基因组中的插入位置对其表达的影响。4.共抑制现象定义：共抑制现象指外源基因的导入不但使外源基因不能高效表达，还会抑

50、制与其同源的內源基因的表达。共抑制最早是在转苯基苯乙烯酮合成酶（CSH）的矮牵牛中发现的。目前，在真菌、动物中均发现类似的现象分别称为抑制、RNA干扰（RNAi）。共抑制现象属于转录后水平的基因沉默（PTGS）。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,5.反义RNA 当外源基因高效表达时，由于特异的mRNA过量积累激活了依赖于RNA的RNA聚合酶活性，并启动合成互补反义RNA，这些RNA可与模板mRNA（包括植物本身与其同源的mRNA）形成部分双链结构（dsRNA），最终被酶降解，使得mRNA含量下降，内外源基因共同失活，反义RNA引起的mRNA的降解被认为是共抑制现象中mRNA降