第18章酵母双杂交系统PPT课件.ppt

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1、第十八章 用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用,刘新光xgliu64163,蛋白质之间相互作用研究的重要性,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,研究蛋白质相互作用的常用方法,酵母双杂交（yeast two hybridization）亲和层析免疫共沉淀蛋白质交联基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法噬菌体显示系统筛选,酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用

2、也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。,第一节 酵母双杂交系统简介,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。,一、酵母双杂交系统的建立和基本原理,经典文献出处,Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6230):245-246,（一）酵母双杂交系统的建立,1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂

3、交系统(yeast two-hybrid system)。该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：,转录激活因子,DNA结合结构域(BD)(DNA binding domain),转录激活结构域(AD)(activation domain),这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。,Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基

4、组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。,Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，

5、这两种蛋白是已知可以相互作用的。,当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合；Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。,酵母转录因子（Gal 4）,与BD-fusion-诱饵（bait）与AD-fusion-猎物或靶蛋白（prey or target protein）,报告基因（reporter gene）-

6、Lac Z（编码-半乳糖苷酶）,（二）酵母双杂交系统的原理,酵母双杂交动画演示（英文）,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合,报道株,经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。,基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS,改造后的酵母细胞的特点：,通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落,表达“诱饵”和“猎物”蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可

7、加入进行营养型筛选的基因。,二、酵母双杂交系统的基本策略,三、酵母双杂交系统的优点,高敏感性。原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过mRNA使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。,三、酵母双杂交系统的优点,高敏感性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时

8、期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。,分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用,四、酵母双杂交系统的应用现状,利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能,将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中

9、可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。,利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。,利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗体的相互作用,利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及 药物对蛋白质之间相互作用的影响,对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的

10、相互作用以达到治疗疾病的目的。,利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）,基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。,五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施,（一）假阳性较多,（二）转化效率偏低,（三）阴性干扰,假阳性定义 在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因

11、仍被激活。,（一）假阳性较多,BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。,原因：,排除假阳性的措施,作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。进一

12、步分析：这种相互作用是否会在细胞内自然发生。有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。,酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。办法：引进酵母接合型 a接合型和接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体）,（二）转化效率偏低,接合型酵母细胞,cDNA文库,诱铒蛋白基因,多克隆位点,DNA-BD 载体,AD 载体,转化,转化,a接合型酵母细胞,筛选平板生长菌苔,筛选平板生长菌苔,同一个三重筛选平板,克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）,鉴定,-半乳糖苷酶,部分已商品化,（三）阴性干扰,融合蛋白的表

13、达对细胞有毒性，该怎么办？应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。,两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。,原因：,酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。,六、酵母双杂交系统使用注意事项,酵母双杂交系统局限性,某些诱饵蛋白具有自身激活性质。-双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系

14、统。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。,酵母双杂交系统局限性,有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。,在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交-用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母三杂交-三种不同蛋白

15、之间的互作研究酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和位点。,七、反向双杂交系统和三杂交技术,(一)酵母单杂交系统(one-hybrid system),1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。,Wang MM,Reed RR.Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast.Nature，1993，364(6433):121-126.,文献出处,酵母单杂交系统原理,在酵母单杂交系统中，省略了在

16、酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNA Gal4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。,酵母单杂交系统原理,理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。,待筛选的蛋白Y或BD结构域同AD结构域融合，蛋白Y上游序列或BD与待目的DNA序列结合，导致AD

17、激活了报告基因表达。,酵母单杂交系统应用,确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。,-研究DNA-蛋白质相互作用,(二)反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system）,2019年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统,Vidal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,Boeke JD.Reverse two-hybrid and one-hybrid syst

18、ems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proc Natl Acad Sci USA，2019，93(19):10315-10320.,(二)反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system）,该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优

19、势。利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。,反向双杂交系统基本原理示意图,反向双杂交系统基本原理示意图,双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。,反向酵母双杂交系统的应用,用于筛选缺陷等位基因的研究 在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因。在反式作用解离分子方面的应用 在蛋白质组研究方面的应用 利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋

20、白质连锁图谱的设想。,第一部分,用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库初步筛选与 CK2相互作用蛋白的候选克隆,1.1 材料 pGBKT7-HCK2 梁景耀构建 Human Testis MATCHMARKER cDNA Library Clontech公司 1.2 方法1.2.1 人睾丸组织cDNA文库质粒的扩增与抽提(1)cDNA文库的滴度测定(2)文库扩增：根据滴度和独立克隆数计算所需文库 原始菌液体积及铺皿个数（共涂布110块LB/Amp 培养基)(3)收集培养基上生长的菌落，制备文库质粒,1 材料与方法,(二)反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid sys

21、tem）,毒性报告基因包括URA3和CYH2等。酵母URA3基因产物一方面为合成尿嘧啶所必需，同时又能催化5-FOA（5-氟乳清酸）转变为毒性物质。URA3既可作为阴性筛选标志(在含有5-FOA的培养基中)、又可作为阳性筛选标志(在不含5-FOA的培养基中)，因此应用得更广泛。,1.2.2 用诱饵质粒pGBKT7-HCK2筛选文库(1)酵母AH109(pGBKT7-HCK2）感受态制备(醋酸锂法）(2)文库转化（分步转化法)(3)检测文库转化效率(4)初步筛选阳性候选克隆 转化混合物接种在75块SD/-His/-Leu/-Trp培养基中阳性克隆重新在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp

22、培养基上划线培养-半乳糖苷酶滤膜影印法初步筛选出阳性候选克隆的转化株,2 结果,2.1 文库的扩增与抽提 文库滴度为3.4109 cfu/ml；文库转化效率为2.3105 cfu/g；共得转化子约1.15107,2.2-半乳糖苷酶滤膜影印分析法鉴定的真阳 性克隆结果 138个克隆呈现蓝色，为阳性候选克隆,3 讨论,酵母株AH109的表型(Ade-，His-，Leu-，Trp-）及用以筛选的原理,酵母筛选的严谨性,高严谨性,低严谨性,最低严谨性,第二部分 相互作用蛋白的进一步确证、cDNA序列测定及其同源性分析,接种在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade的缺陷培养基中,生长5-7天,(可

23、以生长且-半乳糖苷酶阳性为真阳性克隆),扩增纯化阳性克隆中质粒DNA,以T7-Promoter为测序引物,测定文库中与CK2亚基相互作用蛋白的cDNA序列,用GenBank 软件包作序列同源性分析，确定相互作用蛋白名称,提取酵母质粒转化感受态JM109以实现文库质粒的分离并与BD质粒共转化AH109以实现一对一回复性杂交,Fig 14 HL-60 cDNA library construction and the two-hybrid screening procedure 图14 HL-60 cDNA 文库的构建和酵母双杂交的筛选过程,HL-60 cDNA 文库的构建和酵母双杂交的筛选过程,

24、阳性候选克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上重新划线培养各挑取10个-半乳糖苷酶阳性克隆,提取质粒 PCR扩增文库质粒cDNA插入片段限制性酶切分析,1 方 法,1.1 阳性候选克隆的鉴定与分组(将第一部分实验中获得的124号阳性候选 克隆用于进一步分析）,1.2 将从代表性酵母克隆中抽提的质粒转化大肠杆菌 JM109 以实现文库质粒的分离,1.3 单一文库质粒的扩增和纯化,1.4 单一文库质粒自主激活报告基因的检测,1.5 相互作用蛋白的进一步确证一对一回复性杂交,1.6 单一文库质粒插入片段的cDNA序列测定,1.7 相互作用蛋白cDNA序列同源性分析,Fig1 Re

25、striction analysis of the PCR products of the frozen strain by AluLane114:the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/Alu,Fig2 Restriction analysis of the same PCR products of the frozen strain by Hae Lane114:the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,1

26、6,17,18,21,23 PCR products/Hae,Fig 3 8 PCR band types of plasmid extracts of JM109 transformed by yeast plasmid extracts of the restreaked frozen strainsLane 18:PCR product of 4,21,11,12,6,14,17,16 transformed JM109 clones respectively,2.2 酵母质粒抽提物转化JM109,Fig 4-galactosidase assays of AH109 transform

27、ed by library plasmids1:4#;2:6#;3:11#;4:12#;5:14#;6:16#;7:17#；8:21#；N:negative control；P:positive control,2.3 单一文库质粒对AH109自主激活实验,Fig 5-galactosidase assays of AH109 co-transformed by library plasmids and pGBKT7-HCK plasmids 1:4#;2:6#;3:11#;4:12#;5:14#;6:16#;7:17#；8:21#；N:negative control；P:positive

28、control,2.4 一对一回复性杂交实验,2.5 AD/文库质粒插入片段cDNA序列测定结果 及其同源性分析,Fig6 Partial sequence of pACT2-16-1 plasmids,4-1 491 bp 该片段16460 bp与人泛素52氨基酸融合蛋白 cDNA 37481 bp 100%同源,6-1 291 bp 该片段16250 bp与人CK2亚基cDNA 8931127 bp 99%同源,11-1 699 bp 该片段13663 bp与人核酸酶敏感元件结合蛋白1 cDNA 8391489 bp 100%同源,12-1 543 bp 该片段16514 bp与类似人NA

29、DH脱氢酶4 cDNA 11741672 bp 99%同源,Results of DNA sequencing and homologous analysis,14-1 263 bp 该片段29234 bp与人核糖体蛋白L37a cDNA 130335 bp 100%同源,16-1 427 bp 该片段16406 bp与人转换蛋白1 cDNA 13403 bp 100%同源,17-1 1120 bp 该片段1181094 bp与人染色体19上的LLNLR-278H5 克隆 cDNA64405464 bp 99%同源,3 讨论,3.1 AD/文库质粒及其与BD质粒的分离,3.2 酵母双杂交系统的

30、假阳性分析,3.3 筛选到的8种相互作用蛋白的功能及其与蛋白激酶 CK2 的关系,3.3.1 人转换蛋白1的功能及其与蛋白激酶CK2 的关系 转换蛋白(transition proteins,TPs)，主要有转换蛋白1（TP1）和转换蛋白2（TP2）两种类型。在精子细胞变态过程中,核内碱性蛋白质经历了由组蛋白 转换蛋白鱼精蛋白的转换过程，精子细胞核由圆形变 为长形,核高度浓缩。Tnp1基因缺失鼠的精细胞染色体以异常的形式浓缩，并且DNA 链 断裂增多，成熟的精子形态异常，精子活动力降低。本实验首次观察到TP1与CK2间存在的相互作用，对 研究CK2在精子发生中的功能及可能机制有重要意义。,3.

31、3.2 核酸酶敏感元件结合蛋白1的功能及其与蛋白激酶 CK2的关系NSEP1是一种细胞周期特异的转录因子，还有YB1、YBX1、CSDB、DBPB 等别名与细胞增殖有关，具有调节基因的转录、翻译、mRNA剪接及DNA修复等众多功能 通过-干扰素信号转导途径(Jak1/CK2/YB-1途径)可激活 YB-1核易位NSEP-1功能众多，深入研究CK2与NSEP-1之间的关系，对了解CK2在精子发生过程中的信号调节具有重要意义,3.3.3 泛素52氨基酸融合蛋白的功能及其与蛋白激酶CK2的关系泛素主要通过ATP 依赖性的泛素-蛋白水解酶复合体通路途径高效并高度选择性地对蛋白进行完全或部分降解 这一途

32、经在细胞内许多生理过程，例如细胞周期控制、细胞分化、应激反应、离子通道、DNA的修复、细胞凋亡等过程中起着十分重要的作用CK2是否通过这一途径参与众多的生物学功能还有待进一步探讨。,3.3.4 核糖体蛋白L37a的功能及其与蛋白激酶 CK2的关系核糖体蛋白L37a 是核糖体大亚基中一种重要的蛋白质，具有如参与复制、转录、RNA加工、DNA修复、正常细胞的恶性转化及发育调控等重要的核糖体外生理功能。CK2与核糖体蛋白之间的关系也越来越成为一个具有吸引力的课题：已报道核糖体蛋白L22，L5，L41与CK2存在相互作用。本课题组黄功华等也筛选出泛素/核糖体蛋白S27a与CK2亚基发生相互作用,3.3

33、.5 NADH脱氢酶4的功能及其与蛋白激 酶CK2的关系NADH脱氢酶是电子传递链中最重要的黄素蛋白，其基因的高表达可改变膜的通透性，可影响线粒体对细胞凋亡的调节。本实验表明NADH脱氢酶4与CK2之间存在相互作用，这与CK2的物质代谢功能还是与细胞凋亡的功能有关还有待进一步研究。,3.3.6 筛选获得的其它相互作用蛋白 CK2亚基 17-1#、21-1#文库质粒上的插入片段经序列同源分析，未找到已知蛋白mRNA序列与之相对应，它们的表达产物可能是新蛋白,第三部分 用GST-pull down 进一步证实蛋白质间的相互作用,CK2,Experimental Control(GST-Fusion

34、)(GST),GST,GST,TP1,GST,GST沉降示意图,1 原理,CK2,CK2,2.2 方法2.2.1 融合表达质粒 pGEX-4T-1-TP1构建与鉴定,材料与方法2.1 材料 重组人蛋白激酶CK2亚基 陈小文纯化并鉴定,pACT2-16-1质粒和pGEX-4T-1载体的双酶切和定向重组,重组子转化大肠杆菌,重组质粒的筛选,重组质粒的酶切鉴定及测序,2.2.2 GST-TP1融合蛋白的原核表达,重组的蛋白激酶CK2亚基,体外表达获得的GST-TP1融合蛋白,加入到蛋白结合缓冲液中室温孵育,加入已平衡的谷胱甘肽琼脂糖珠，室温孵育,蛋白结合缓冲液洗涤，除去非特异结合蛋白,SDS-PAG

35、E分析,同时设立GST作为阴性对照,2.2.3 GST融合蛋白沉降实验,3结果,3.1重组质粒的筛选,Fig 7 The screening of recombinant human transition protein 1 transformants Clone 17,915 are positive clones;Clone 8 is a vector plasmid,3.3 GST-TP1融合蛋白的原核表达,Fig 9 SDS-PAGE of the expressed recombinant human GST-TP1 in the transformed bacteriaLane 1

36、:soluble fraction of lane 3;Lane 2:precipitated fraction of lane 3；Lane 3:crude extract of IPTG-induced bacteria transformed by pGEXGST-TP1;Lane 4:crude extract of bacteria transformed by pGEXGST-TP1 that wasnt induced by IPTG;M:protein molecular weight standard,3.4 GST 融合蛋白沉降实验结果,CK2,GST-TP1,GST,Fi

37、g 10 GST pull down assay M:protein molecular weight standard Lane 1:GST Lane 2:GST-TP1+CK2 Lane 3:CK2,4讨论,GST-pull down实验在细胞外直接检验蛋白质分子间相互作用细胞内及细胞外实验都证实TP1与CK2亚基有相互作用 蛋白激酶CK2可能与精子细胞变态有关,本研究有待于进一步研究的方向：,用免疫共沉淀、细胞内共定位分析等方法进 一步确定上述经酵母双杂交筛选出的相互作 用蛋白,通过对相互作用蛋白的原核表达及其纯化并通过 激酶反应等来确定其是否为CK2的磷酸化底物,研究CK2与TP1之间

38、的功能关系，进一步 阐明在精子发生中的作用机制及其意义,小结,经人睾丸cDNA文库质粒转化感受态的AH109（pGBKT7-HCK）细胞，初步筛选获得138 个阳性候选克隆,经进一步确证和分组，从124号阳性候选克隆 中筛选出8种与蛋白激酶CK2相互作用蛋白,成功地将8种在大肠杆菌分离得到的文库质粒 单独转化AH109，并排除了文库质粒本身对 AH109菌株的自主激活活性,将上述8种文库质粒与BD质粒共转化AH109以 实现一对一回复性杂交，最后证实都表现出有 相互作用,成功测出8种相互作用蛋白插入片段的cDNA序 列，并确定了其名称。,细胞内及细胞外实验都证实蛋白激酶CK2 与人转换蛋白TP1之间有相互作用,