离子交换层析原理ppt课件.ppt

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1、第五章离子交换层析,离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。,1848年，Thompson 等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。,第一节 基本原理,在水中呈不溶解状态，

2、能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。,离子交换剂,特性,离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+RB+A+该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。,离子交换反应,示意图（离子交换过程）,电离基团（磺酸根）,可交换离子（钠离子）,交换离子,不交换离子,离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大小取决于离子交换剂的选择

3、性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示：KRBA+/RAB+如果反应溶液中A+等于B+，则KRB/RA。若K1，即RBRA，表示离子交换剂对B+的结合力大于A+；若K=1，即RBRA，表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同；若K1，即RBRA，表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。,影响离子交换选择性的因素,水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性影响亦大。离子强度：越低越好；有机溶剂：不

4、利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；,如Na+Ca2+Al3Si4。如原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增加而增大，如Li NaKPb。在稀溶液中适用。,在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是：CH3COOFOHHCOOClBrCrO42NO2IC2O42 SO42柠檬酸根。弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：FC1Br=ICH3COOMoO42PO43AsO43NO3酒石酸根柠檬酸根CrO42SO42OH。,1、竞争；2、增加

5、蛋白质的水合作用，降低吸附和交换速度。,两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当pHpI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pIpH时，pI越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。,离子交换机理,A+自溶液中扩散到树脂表面A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心A+与RB在活性中心上发生复分解反

6、应解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面B+离子从树脂表面扩散到溶液中交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制,影响交换速度的因素,颗粒大小：愈小越快交联度：交联度小，交换速度快温度：越高越快,与扩散系数增加有关离子化合价：化合价越高，扩散速度小离子大小：越小越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快,离子交换层析的基本原理,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱

7、液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,+,+,+,+,+,+,+,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4.解吸附阶段：梯度缓冲溶液先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,第二节 离子交换剂的分类及性质,一、离子交换剂的类型 根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。(1)疏水性离子交换剂 是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的

8、性质不同，又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树脂。,阳离子交换剂：,阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱，可分为强酸型(带磺酸的基团，RSO3H)、中强酸型（含磷酸基团或亚磷酸基团，RPO3H2）及弱酸型（带羧基和酚基的树脂，RCOOH或R苯环OH）三种。这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下式所示：RCOOHNa+RCOONaH+,阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺-NHCH3和伯胺-NH2基团后构成的。依据胺基碱性的强弱，又可分为

9、强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：,螯合离子交换剂：,这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。疏水性离子交换剂含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷酸及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如SDS)、去污剂(如TritonX100)、尿素、两性电解质等。,(2)亲水性离子交换剂,与

10、水亲和性较大，有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。纤维素离子交换剂 又称离子交换纤维素，是以微晶纤维素为基质，引入电荷基团构成的。分为强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂中，最广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纤维素和羧甲基(CM一)纤维素。近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用，制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAESephacel)，结构与DEAE一纤维素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。,微晶纤维-又称纤维素胶或结晶纤维素 性状：白色或几乎白色的细小粉末，无臭，无味，可压成自身粘合的小片，并可在水中迅速分散，不溶于水

11、、稀酸、稀碱溶液和大多数有机溶剂。制法：将纤维性植物材料与无机酸捣成浆状，经处理使之降解后漂洗、研磨、脱水、烘干、粉碎制成。,目前常用的纤维素交换剂,离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。特点：结构疏松，对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性；表面积大，因而有较大的吸附容量；基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰；电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结合在其分子上的解离基团数量不多，故交换容量小，仅为交换树脂的1/10左右。,交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂是

12、以交联葡聚糖G25和G50为基质，通过化学方法引入电荷基团而制成的。交换剂G50型适用于相对分子质量为31043106的物质的分离，交换剂G25型能交换相对分子质量较小(11035103)的蛋白质。交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶相似，在强酸和强碱中不稳定，在pH7时可耐120的高热。它既有离子交换作用，又有分子筛性质，可根据分子大小对生物高分子物质进行分级分离，但不适用于分级分离相对分子质量大于2105的蛋白质。,琼脂糖离子交换剂主要以交联琼脂糖CL6B为基质，引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积

13、变化不大。如DEAESepharose CL6B为阴离子交换剂；CMSepharose CL6B为阳离子交换剂,它们的外形呈珠状，网孔大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。,按骨架结构不同，离子交换树脂可分为：凝胶型和大孔型。,苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯聚合而成，透明，没有毛细孔，吸水后形成微细的孔隙，适合交换无离子等小分子。,苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯的异构体聚合，经过特殊的物理处理，行成大网孔，再导入交换基团制成，不透明，既有微孔又有大粗孔，吸附大分子，耐污染。,疏水性离子交换剂（树脂）的命名,（D）（D）大孔型 无凝胶型分类代号0

14、强酸 1弱酸 3弱碱 4螯合 5两性 6氧化还原活性基团骨架名称0苯乙烯系 1丙烯酸系 2酚醛系 3环氧系 4乙烯吡啶系 5脲醛系 6氯乙烯系顺序代号用以区别交换基团或交联剂的差异。交联度（%）,例：0017 凝胶型苯乙烯系强酸阳离子交换树脂交联度为7%D001 大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,亲水性离子交换剂的命名,交换基团写在前面，然后写骨架，最后写原骨架的编号。在编号前加C、A以区分阳离子和阴离子。如：DEAE-Sephadex A-25 CM-Sephadex C-25,二、性质,1、颜色与形状树脂类离子交换剂：褐色、黄色、乳白色等 亲水性离子交换剂：白色 珠状 2、交联度 交联度：

15、交联剂在离子交换剂中的比例，用重量百分率表示。,3、膨胀度（吸水量）膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时 间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。影响膨胀度的因素有：（1）、基质（2）、电荷基团（3）、离子强度和pH值,亲水性离子交换剂大，疏水性离子交换剂小。与交联度的关系。,强碱和强酸大于弱碱和弱酸；电荷数和性质相同，相差不大。,交联度大的离子交换剂对离子强度和pH值不敏感。交联度小或者弱的离子交换剂相反。,4.交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mg或meq/

16、ml）表示。总交换容量：理论交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。有效交换容量：实际交换容量，与实验条件有很大的关系，后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。,影响交换容量的因素：1、筛孔要根据被分离的对象来选择。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大，交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。,2、离子强度 一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换

17、剂上的样品组分洗脱下来。3、pH值 首先pH值影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。其次影响离子交换剂的解离程度。,pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。,交换容量的测定法,（1）强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1molL的NaOH处理，去离子水洗至中性，1molL的HCl处理，去离子水洗至中性。然后用1molL的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的

18、质量，即可得到交换容量。,（2）强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1molL的HCl处理，去离子水洗至中性，1molL的NaOH处理，去离子水洗至中性。然后用1molL的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。,（3）凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1molL的NaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定

19、浓度的NaCl或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按计算公式计算交换容量。,5其它,稳定性，离子交换剂稳定性都较好，特别是树脂类离子交换剂，在浓度较高的酸或碱溶液中进行短期处理后，其性质仍无改变。而亲水性离子交换剂的理化稳定性一般与其基质的稳定性相近。与树脂类相比，稳定性差，易被污染。比重，离子交换剂经过溶胀处理后的比重是恒定的。不同的溶液中溶胀处理后的比重是有差异。流速，一般是由离子交换剂的性质、操作压、层析柱体积和分离样品的要求等因子控制的。在操作压和其它层析条件相同的情况下，离子交换剂的颗粒大，洗脱液的黏度小，流速就快，反之流速则慢。,第三节 离子交换剂与缓冲液的

20、选择,一、离子交换剂的选择 应用离子交换层析技术分离物质时，选择理想的离子交换剂是提高获得率和分辨率的重要环节。任何一种离子交换剂都不可能适用于所有的样品物质的分离，因此必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质，选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。,选择离子交换剂的一般原则如下：(1)阴、阳离子交换剂选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。(2)强、弱离子交换剂选择 强型离子交换剂适用的pH范围很广，常用来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较

21、稳定的物质。弱型离子交换剂适用pH范围狭窄，在pH为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。,(3)不同离子型交换剂的选择 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子，因为其它离子都会对纯水有污

22、染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。,(4)不同基质离子交换剂的选择 交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。,二、缓冲液的选择,离子交换剂不仅要与被分离的物质交换,还要求与缓冲液进行交换。选用的起始缓冲液，其pH值和离子强度等要么能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合，pH值一般比有效成分的pI

23、值高一个单位或低一个单位，就能把有效成分和杂质分开。或者选择缓冲液的离子强度和pH值，使杂质和离子交换剂结合牢固，有效成分和离子交换剂结合不牢。洗脱液的选择主要是使和离子交换结合的成分解离下来。离子强度比起始缓冲液高。缓冲液的选择关键在于有效成分的等电点。对于一种提取分离的未知有效成分而言，其等电点须通过试验才能确定。选择缓冲液的方法(见P89)MoNoQ:阴离子交换层析,颗粒直径10um,载量65mg BSA/ml MoNoS:阳离子交换层析,三、加样量的确定 层析时加样量的多少除与离子交换剂的总交换容量大小关系密切外，还与样品中有效成分的吸附性能以及有效成分与杂质之间的比例等因子有关。,第

24、四节 操作,一、交换剂的预处理、再生和转型商品离子交换树脂为干树脂，因含有一些水不溶性杂质，所以要处理，一般程序如下：干树脂加过量的水除去细颗粒，再用水浸泡2小时后减压抽去气泡，倾去水，再用大量去离子水洗至澄清，去水后加4倍量的2mol/L HCl溶液，搅拌4小时，除去酸液，用水洗至中性，再加4倍量的2mol/L NaOH溶液，搅拌4小时，除去碱液，用水洗至中性备用。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。如果是亲水型离子交换剂，只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl溶液处理(室温下处理30分钟)。,离子交换剂的再生

25、是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用HCl处理可将其转为Cl型，用NaOH处理可转为OH型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。,长期使用后的树脂含杂质很多，欲将其除掉，应先用沸水处理，然后用酸、碱处理之。长期使用的树脂，需先用沸水处理，然后用酸处理，若含有脂溶性杂质，可用乙醇或丙酮处理。长期使用过的亲水型离子交换剂的处理，一般只用酸、碱浸泡即可。对琼脂糖离子交

26、换剂的处理，在使用前用蒸馏水漂洗，缓冲溶液平衡后即可。离子交换剂去除杂质的原则：不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有的交换容量。,二、分离物质的交换,有两种方法：柱层析法（动态法）分批法（静态法）离子交换剂的装柱量，要依据其全部交换量和待吸附物质的总量来计算，当溶液中含有各种杂质时，必须考虑使其交换量留有余地。例子见书P93,(1)离子交换层析柱选择 简单的层析柱可用碱式滴定管代替，底部熔接有滤板。柱的高度依分离物质的不同而定，当所用的交换剂与待分离物质各组分之间的亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大时，可增加柱的长度，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，使性质相近的组分

27、能较好地分离，因而增加了分辨率。柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。如采用离子强度较大的梯度洗脱时，以选用粗而短的柱子为宜柱高与直径的比例要降低，甚至为2：1。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为1520cm。,三、样品上柱、洗脱和收集,(2)装柱,转型再生好的交换剂先放入烧杯，加少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应

28、有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的13，再加入交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。离子交换剂的装柱量要依据其全部交换量和待吸附物质的总量来计算。当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的2550计算。在样品纯度很低时，或有效成分与杂质的性质相近时，实际交换量应控制得更低些。,装柱完毕，通过恒流泵加入起始缓冲溶液，流洗交换剂，直至流出液的pH与起始缓冲

29、溶液相同。关闭层析柱出液口，准备加样。打开柱出液口，待缓冲溶液下移至柱床表面时，关闭出液口。用滴管加入已用起始缓冲溶液平衡后的样品。沿柱内壁滴加样品，待样品液加到一定高度后，再移向中央滴加，务必使样品液均匀分布于柱床全表面。然后打开出液口，待样品液全部流人柱床时，先用少量起始缓冲溶液冲洗柱内壁，再接上洗脱装置，按一定速率加入洗脱液，开始层析分离。,经过离子交换被吸附在离子交换剂上的待分离物质，有二种洗脱办法：一是增加离子强度，使洗脱液中的离子能争夺交换剂的吸附部位，从而将分离的物质置换下来；二是改变pH，使样品离子的解离度降低，电荷减少，因而对交换剂的亲和力减弱而被洗脱下来。从洗脱液的成份而言

30、，洗脱方式有三种：一是选用单一洗脱液。此为恒液洗脱法，适用于组分不大复杂的样品；二是选用几种洗脱能力逐步增强的洗脱液相继洗脱，此为阶段洗脱法，适用于各组分对交换剂亲和力比较悬殊的样品；三是用离子强度和pH呈连续梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续增强，此为梯度洗脱法，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样品。,在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，溶液的梯度是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。,由于被吸附的物质不一定是所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外，还采用控制流速和分部收集的方法来获得所需的单一物质。因不同物质的极性不同，容易交换的先流出来，根据先后顺序就能得到较纯的物质。,洗脱

31、液的流速不仅与所用交换剂的结构、颗粒大小及数量有关，而且与层析柱的粗细及洗脱液的粘度有关，很难定出一定的标准，必须根据具体条件，反复实验，才能得出适合于特定层析条件的洗脱液流速，一般控制在58mL(cm2h)。经洗脱流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的体积一般以柱体积的12为宜。若降低分部收集体积，可提高分辨率。分部收集洗脱液经相关的检测分析，便可得知所含物质的数量。也可以用监测仪显示收集的洗脱液在特定波长的吸光度(A)代表被分离物质的浓度，以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。,在某些实验条件下，离子交换层析的洗脱，也选用阶梯式或复合式梯度洗脱液。实践中采用何种形式的梯

32、度洗脱，完全决定于分离要求，无规律可循。一般从线性梯度开始，然后逐步摸索试验，以获得适用于实验的合适洗脱方式。,部分收集器,梯度混合器,层析柱,柱层析设备,可见光分光光度计,蠕动泵,企业利用的层析柱,第五节 离子交换层析的应用,离子交换层析的应用范围很广，主要有以下几个方面。(1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过H+型强阳离子交换剂，去除各种阳离

33、子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH-型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。,(2)分离纯化小分子物质 离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2-3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。,(3)分离

34、纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。,（4）测定蛋白质的等电点 见书P99,第六节 生化用离子交换剂的特点和种类,一、生化用离子交换剂的特点1、亲水性和生物相容性2、孔结构3、电荷密度4、粒度5、纯度,水溶性为生物大分子提供适宜的微环境。,兼分子筛和离子交换的双重作用，要求孔径更加均匀。,密

35、度适当，太大导致洗脱困难。,粒径小，在20-30um范围内，生物大分子扩散速率小，运动阻力大通过交换速度只有减少粒径。,工业级分析级生物技术级分子生物级,二、生化用离子交换剂的种类 生化专用离子交换剂 1、纤维素类 2、葡聚糖系Sephadex离子交换剂 琼脂糖系离子交换剂等。,作业3,1 名词解释1）吸附剂：2）固定相：3）流动相：4）分配系数：2 吸附剂的比表面积对吸附容量有何影响？如何克服细颗粒吸收剂流速减慢的问题？为什么？3硅胶的颗粒大小、悬浮液的浓度、展层剂的饱和状态对分离物的Rf值或流速有何影响？,作业4,1 离子交换剂由哪几部分组成？何谓阳离子和阴离子交换剂？2 解释选择系数KBA、转型及再生的含义？3 现有肌苷样品液100mL，浓度为2mol/L，每克干树脂（膨胀度为1.5）总交换量为3.5mmol而实际交换容量是总交换量的5%问使用多长的层析柱（直径：长度=1：10）为宜？4 影响离子交换剂膨胀的因子有那些？其中哪个为关键因子？为什么？,