真核生物基因组总DNA的提取与鉴定ppt课件.ppt

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1、基因组DNA的分离与纯化,一、酚抽提法的原理,以含EDTA、SDS的裂解液裂解细胞，经蛋白酶K消化后，用PH8.0的Tris 饱和酚抽提蛋白质，离心后取上层水相，无水乙醇沉淀DNA。,二、技术路线,破 膜,提 纯,沉淀、洗涤,细胞膜碎片，细胞器，脂、蛋白质，DNA，RNA,去除脂、蛋白质,浓缩DNA、去盐杂质,1.低渗去除红细胞,2.裂解白细胞,3.酚抽提,4.无水乙醇沉淀,5.DNA沉淀的洗涤与干燥,6.DNA溶解与电泳鉴定,三 结果,琼脂糖凝胶电泳鉴定,EB与DNA的结合,EB可嵌入到碱基平面，使核酸在 UV 激发下发出桔红色荧光。,三 结果,琼脂糖凝胶电泳鉴定,The End,裂解液的作

2、用,裂 解 液,EDTA,SDS,Tris-HCl,DNA酚抽提法示意图,酚的作用,酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA进入水相。,DNA酚抽提法示意图,蛋白酶K的作用,水解组蛋白，促进DNA与组蛋白的分开。,DNA的沉淀,无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaAc等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。,TE,10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,上样缓冲溶液（6 或10）,溴酚蓝（电泳指示剂，约相当于300bpDNA）,二甲苯氰（电泳指示剂，约相当于4000bpDNA）,甘油/蔗糖（增加DNA溶液的密度）,0.51.4%琼脂糖凝胶,水相的吸取,SDS（去垢剂）,