石蜡切片的制作及HE染色ppt课件.ppt

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1、石蜡切片的制作及H.E染色,实验目的实验原理实验用品,方法与步骤实验结果实验报告,实验目的,掌握小鼠组织石蜡切片的制作过程掌握HE染色的基本原理和染色方法,实验原理,利用光学显微镜对生物样品进行观察，需要样品必需要一定的厚度范围内，才能保证光线的透过性。由于生物样品多为软性材料，所以必需将其包埋在一定的固体支持物中，常用的支持物有石蜡、火棉胶等。其中石蜡切片是最常用的光镜样品制片技术。苏木素（Hematoxylin）与伊红（Eosin）对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的方法。这种方法染色广泛，对组织细胞的各种成份都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染

2、色后不易褪色可长期保存。经过HE染色细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。,实验用品,实验器材：恒温箱、切片机、解剖器械、载玻片、酒精灯、染色缸和烧杯等。实验试剂：Carnoy固定液；二甲苯；各级浓度的酒精溶液；Ehrlich苏木精染液；伊红染液实验材料：小鼠小肠或肝组织,方法与步骤,石蜡切片样本的制作HE染色,石蜡切片制作过程,切片前的设备试剂准备,取材,固定,修块,冲洗,修切,脱水,透明,包埋,修蜡,切片,粘片,烤片,脱蜡,入水,染色,脱水,透明,封片,烘干后粘贴标签。,1、取材:断头处死小鼠，剖开腹腔，取出一部分肝组织，生理盐水冲洗，将其修切成小块，取材要迅速且组织块尽量小

3、（5*5*2mm）,肝脏,2.固定,肝组织切成小块，用固定液固定24小时。固定的作用：1:防止自溶 2:防止膨胀和收缩 3:使组织块硬化便于制片4:保持原有状态 5:防止组织块在制片过程中损坏。6:使不同组织产生不同的折光率，对染料不同的亲和力。,3.脱水,70%的乙醇三级，每级15分钟85%的乙醇一级，每级15分钟95%的乙醇一级，每级15分钟 100%的乙醇三级，每级15分钟,4.透明、透蜡,100%的乙醇（1/2）+二甲苯（1/2）5分钟100%的乙醇（1/3）+二甲苯（2/3）5分钟纯二甲苯两级，每级5分钟二甲苯（2/3）+石蜡（1/3）15分钟二甲苯（1/2）+石蜡（1/2）15分钟

4、二甲苯（1/3）+石蜡（2/3）15分钟纯石蜡三级，每级2030分钟,5.石蜡包埋,6.切片,材料上切片机切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上略烤，使切片展平，将贴好的片子于室温老化37天后，即可用于染色。,1、将单张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中（光亮的一面朝下）立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。2、待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中轻靠切片，随即将玻片直立提起，拨正切片位置。3、用铅笔在玻片的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。4、贴好的切片置于60恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。,7.贴片,切片到水；染色；蓝化；分

5、化；切片再入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后入蒸馏水漂洗一次；切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各35 min；复染；放入95%乙醇中洗去多余的红色，入无水乙醇中35 min；二甲苯透明，封片，镜检。,染色,切片入苏木色精中染色约1030 min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。,蓝化,用自来水流水冲洗约15 min。冲洗过程中使切片颜色发蓝。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或入碱性水也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，

6、如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。,分化,就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸酒精液（盐酸1份70乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，如分化不当会导致染色不匀、或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。,复染,用0.5%伊红酒精液（伊红0.5 g 95乙醇100 ml）对比染色25 min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木色精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红酒精液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。,实验结果,实验报告,绘图表示H.E染色的染色结果；在H.E染色中有哪些需要注意的步骤？,