生物化学4抗体制药ppt课件.ppt

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1、第四章 抗体制药,4.1 概述4.2 单克隆抗体4.3 基因工程抗体4.4 多功能抗体4.5 抗体库技术4.6 抗体诊断试剂4.7 抗体治疗药物,4.1 概述,抗体（antibody）：能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。抗体通过以下途径中和和除去有害物质：直接使抗原失去活性促使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏使抗原表面弱化而易于受补体破坏,结晶片段Fragment crystallizable,IgM,IgG,IgA,IgD,IgE,抗原结合片段fragment of antigen binding,110aa,抗体研究的3个阶段：1、多克隆抗体含针对多个

2、不同抗原决定簇的不同抗体不同淋巴细胞产生、针对同一抗原区存在多种抗体 中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒素）非特异性交叉反应不能应用肿瘤和其他疾病治疗。,2、单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）仅识别单一抗原决定簇由同一细胞产生 高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产。McAb（monoclonal antibody）在临床上主要用于诊断和治疗：疾病的诊断 检测某疾病相关的抗原（ELISA）治疗 抑制器官移植排斥（抗分化抗原CD3 单抗）作为药物载体对肿瘤进行定向治疗,McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、鼠源性，产生人抗鼠抗体（HAMA，human antim

3、ouse antibody），排斥反应，半衰期短，难维持有效药物作用靶组织时间；B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题A、降低McAb的免疫源性B、降低McAb的相对分子质量,3、基因工程抗体 人源化抗体（嵌合抗体，chimeric antibody；改形抗体，reshaping antibody；等）基因工程抗体片断（单链抗体，scFv，single chain antibody；单域抗体VH或VL等）抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，Fc片断所具有的补体激活、免疫调理等各种生物功能丧失。,4.2 单克隆抗体,McAb是将抗体产生细胞与具有无限增

4、殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。,杂交瘤技术操作流程图解,一、抗原与动物免疫 抗原：种类上无限制（纯化分子、病毒、细菌、细胞等）纯度无绝对要求（尽可能高纯度抗原）动物：骨髓瘤细胞系同品系动物（BALB/c小鼠和Lou大鼠）,免疫方法：体内免疫 皮下、肌肉及腹腔免疫 颗粒性抗原（无需佐剂）可溶性抗原（加佐剂）脾内免疫 手术暴露脾脏，直接注入 来源有限、昂贵抗原 免疫效果差体外免疫 从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入抗原共培养45天。,二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 骨髓瘤细胞：自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。HGPRT

5、-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）融合过程：取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*1073*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。HAT选择性培养基培养,动物细胞核苷酸合成两条途径：全合成途径、补救合成途径 氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻断了阻断GMP、TMP的生物合成。GMP、TMP的补救合成途径：GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下由

6、次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine,T）合成。,A:氨基喋呤H:次黄嘌呤 T:胸腺嘧啶,抗原免疫小鼠,HGPRT-骨髓瘤细胞,PEG,脾B细胞,HAT培养基选择培养,B-瘤（2周）,B、B-B、瘤、瘤-瘤、B-瘤,瘤细胞无补救途径，同时全合成途径被A阻断，不能存活；B细胞具有补救途径但不能长期存活；B-瘤细胞具有补救途径又可长期存活,三、筛选阳性克隆与克隆化,检测方法：免疫酶技术（ELISA常用）、免疫荧光技术、放射免疫技术,克隆化 克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使

7、每孔中在理论上只含有一个细胞。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，培养基为半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。加入饲养细胞 杂交瘤细胞染色体不稳定，易丢失，反复克隆化，34次，至各孔100%抗体阳性,四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1、染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为6268，NS-1为5464，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的

8、抗体；反之，则反,2、分泌抗体稳定性分析 连续传代，检测上清中抗体浓度；一般需3个月。3、Ig类别及亚类鉴别 羊或兔抗Ig不同类或亚类的抗体 免疫扩散或ELISA。4、亲和力测试高亲和力：体内应用或检测试剂低亲和力：亲和层析5、抗原识别位点等其他测试,Ig,抗IgG1抗体,抗IgG2抗体,抗IgA抗体,抗IgD抗体,抗IgE抗体,五、单克隆抗体的大量制备1、动物体内诱生法 520mg/ml抗体 基本程序：接种前12周，同品系鼠腹腔注射0.5ml 降植烷或液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成后注射器抽取，离心去细胞沉淀即得单抗腹水，每只小鼠可得35ml。,优点：操作简便，

9、比较经济，抗体浓度高，多用于研究和诊断等一般用途，为一般用途单抗制备首选。缺点：混有来自小鼠的非特异性抗体，给纯化带来难度。,2、体外培养法 悬浮培养、微载体培养等动物细胞大规模培养方式 抗体浓度比动物体内诱生发低 用于防病治病单抗的工业化生产 最好采用无血清培养,六、单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：体外诊断试剂IgG类-沉淀处理+亲和层析IgM类-沉淀处理+凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析+阴离子交换层析,六、单克隆抗体的纯化 动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：1.11.9%正辛酸等电点沉淀白蛋白（血清中主要杂蛋白),再

10、硫酸铵沉淀。,（2）分离凝胶过滤 用于IgG和IgM类。Sephadex G 200 3个峰，分子量最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。抗体回收率5080%，纯度可达95%以上。阴离子交换层析 适用于IgG类的分离纯化。,亲和层析 适用于IgG类 蛋白A（protein A,金黄色葡萄球菌）蛋白G（protein G，G群链球菌）IgG的 Fc片断 蛋白A、蛋白G与不同属来源的抗体结合强度不同 pH8.0 结合在亲和柱 降低pH至2.53之间进行洗脱,细胞培养液中单抗的浓缩：,4.3 基因工程抗体,互补性决定区(CDR，complementarity determinant region)骨

11、架区（FR,frame region）,Vk1,一、嵌合抗体（chimeric antibody）将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来的抗体。免疫原性大幅度降低。保留抗原结合特异性。,构建过程：,提取杂交瘤细胞mRNA,反转录成cDNA,RT-PCR分别扩增 VL、VH 基因,表达载体共转染骨髓瘤细胞,分别与人的轻链、重链恒定区基因相连,人-鼠嵌合抗体,1516aa,二、改形抗体（reshaping antibody）抗原结合区域：H和L链 V区中的互补性决定区(CDR，complementarity determinant region)将鼠源性单克隆抗体的CDR以外序列替换人 Ig

12、分子中的序列，可基本消除免疫原性。改型抗体也称CDR移植抗体(CDR grafting antibody)。,1516aa,构建过程：,1516aa,问题：抗体亲和力下降原因：骨架区（FR,frame region）影响CDR的空间结构。提高亲和力：从已知人可变区数据库中选择骨架区与鼠抗骨架区同源性最高的序列骨架区内可能影响抗原结合的氨基酸残基替换为鼠抗残基：立体结构数据、结构预测、分子设计推测,合适保留CDR两侧骨架区序列 大都涉及VL、VH相互作用以及与CDR接触选择性保留可变区N末端的数个氨基酸残基 N末端与CDR表面相距很近，可能参与抗原结合,三、镶面抗体（resurfacing an

13、tibody）抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保守，不因种属和型别改变。为免疫原性主要来源 将鼠抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基改为相应的人源残基，使可变区表面人源化。消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。,四、小分子抗体Fab片断（fragment of antigen binding）完整轻链和重链Fd段（单价）完整抗体的1/3 木瓜蛋白酶水解抗体 重组方式生产 抗原特异性、制作简单,Fv与单链抗体（single chain Fv，ScFv）（1）Fv（可变区片断）VL、VH非共价键结合（单价）完整抗体的1/6 基因工程重组生产 易解离,（2）ScFv 常用连接肽：(Gly4S

14、er)3 优点：分子量小（1/6），免疫原性低容易进入瘤体组织无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低单链容易改造可采用大肠杆菌大量生产,缺点：单价，亲和力下降半衰期短，体内清除过快功能单一，仅能与一种抗原结合可形成scFv二聚体和多聚体,3.单域抗体 VH或VL 仍保留了抗原结合活性 亲和力低4.分子识别单位（MRU，molecular recognition unit）单个 CDR区 亲和力相当低,4.4 多功能抗体,一、双功能抗体(bispecific antibody,BsAb)具有两种抗原结合特性主要指双特异性单链抗体(bispecific single-chain Fvs,BsFvs)构建

15、双特异性单链抗体的方式：末端半胱氨酸残基共价交联 大肠杆菌表达,链间连接肽相连微型抗体 利用专门的二聚化结构域将两scFv连接成异二聚体 亮氨酸拉链（a螺旋每两圈7个氨基酸出现一个亮氨酸，位于同一侧）转录因子Fos和Jun蛋白中含亮氨酸拉链，形成稳定Fos-Jun二聚体 其他二聚体结构：螺旋-转角-螺旋等,双体形式 短连接肽（312aa）:同一scFv分子内VH和VL内不能配对，只能和另一分子VH和VL配对，形成双体分子。,双特异性抗体的应用：在免疫诊断中应用 两 抗原结合位点分别设计为针对靶抗原和酶分子 可取代酶标抗体 优点：不需要标记抗体，避免化学交联抗体和酶对蛋白的损伤，生物活性高，可大

16、量制备，应用方便。例（肝癌等癌症诊断）：抗辣根过氧化物酶(HRP)-抗甲胎蛋白（AFP）双特异性抗体ELISA 检测AFP最低浓度5ng/mL,在肿瘤放射免疫显像中应用 一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端能与带放射性核素的半抗原结合 二次导向：先注入双特异性抗体定位肿瘤，一定时间后游离抗体被清除 注入放射性核素的半抗原，定位于肿瘤细胞 与常规放射免疫显像比，可提高清晰度和灵敏度,双特异性抗体介导的药物杀伤效应 常规肿瘤导向：单抗与化疗药物、毒素或放射性核素偶联 导致抗体或偶联药物失活 双特异性抗体 很好避免这点 双特异性抗体介导的细胞杀伤效应 一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端针对免疫活性细胞表面

17、的效应分子，活化该细胞,二、多功能抗体 将scFv链内连接肽从12aa减少0aa，可形成二聚体、三聚体、四聚体等。分子量比scFv大，克服scFv清除速度过快的缺点 多价，亲和力增强 成功报道的不多,三、抗体融合蛋白 将目的蛋白基因与抗体或抗体部分片断基因相连表达出来的重组蛋白。目的蛋白：细胞因子、受体、酶、配体等。目的蛋白与抗体或抗体可变区片断（scFv、Fab等）融合 利用抗体的特异性结合，将生物活性靶向至特定部位 重组免疫毒素：蛋白毒素（蓖麻毒素、白喉毒素等)-抗体片断 抗体-细胞因子 酶-抗体：抗体靶向的酶前体药物治疗（antibody directed enzyme prodrug

18、therapy，ADEPT）抗体、酶、前体药物,前体药物,药物,目的蛋白与抗体恒定区片断（Fc）融合,Fc片断作用：增加蛋白的半衰期可利用protein A进行亲和层析Fc具有补体激活、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等生物活性CD4-Ig：CD4-Fcr HIV病毒表面糖结合CTLA4-Ig:CTLA4的胞外区-Fcr(细胞毒T淋巴细胞抗原4),CTLA4-Ig:CTLA4(细胞毒T淋巴细胞抗原4)的胞外区-Fcr 抑制器官移植的免疫排斥反应 与B7分子结合,阻断T细胞活化的第二信号 Fc 有利于Protein A纯化，CTLA4 为免疫球蛋白超家族成员,胞外段与Ig Fc段结合后能较好维持分子

19、完整性和空间结。,T淋巴细胞,CD28,CTLA-4,B7,CTLA4-Ig,4.5 抗体库技术,早期用于构建基因工程抗体的抗体基因来源于杂交瘤细胞，杂交瘤细胞为鼠源且要经过动物免疫、细胞融合、筛选复杂过程，获得的抗体基因还需进行改造。20世纪90年代，产生抗体库技术。两大突破：PCR出现和发展，使得一套引物可扩增全套免疫球蛋白可变区基因利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片断,抗体库（antibody library）技术：克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组到特定原核表达载体中，转化大肠杆菌表达有功能的抗体分子片断，通过亲和筛选得到特异性抗体可变区基因的技术。经历了组合抗体库

20、、噬菌体抗体库、核糖体展示抗体库3个阶段。噬菌体抗体库发展最成熟、应用最广泛。,噬菌体抗体库技术是在噬菌体展示（phage display）基础建立的。丝状噬菌体（M13、fd、f1）P3、P8 N端融合 P3展示系统（展示数百氨基酸，适合筛选高亲和力配体）P8展示系统,外源基因插入在特殊的质粒，即噬菌粒上，噬菌粒含质粒和噬菌体的复制起始点，但需要辅助噬菌体提供产生单链所必需的蛋白。噬菌体的繁殖需要野生型P3、P8蛋白，也由辅助噬菌体提供，野生型的P3(或P8蛋白)和P3融合蛋白(或P8融合蛋白)共同组装到噬菌体颗粒的表面。噬菌体颗粒中单链DNA主要来自于带外源基因的噬菌粒。,有缺陷的噬菌体复

21、制子,P3、P8、P5等蛋白,辅助噬菌体,P3外源蛋白融合蛋白,噬菌体抗体库的构建：扩增全套抗体可变区基因 从人外周血获取B细胞，提取B细胞mRNA，RT-PCR扩增全套抗体可变区基因构建合适的噬菌体表面展示载体 Fab抗体库展示载体 scFv抗体库展示载体转化大肠杆菌,Fab抗体库展示载体pComb3 周质腔表达,P3,scFv抗体库展示载体pHEN2 周质腔表达琥珀型终止密码子TAG 琥珀突变（supE，编码琥珀突变 型tRNA)抑制菌株 谷氨酸,噬菌体抗体库的筛选：9天可完成3次筛选 对目的克隆进行表达和检测,噬菌体抗体库技术的特点：能包含B细胞全部克隆，库容量大，可筛选到各种抗体避开了

22、人工免疫和杂交瘤技术，直接获得抗体基因可获得高亲和力的人源化抗体筛选得到的抗体更易于在大肠杆菌中表达,噬菌体抗体库为抗体工程发展的一个里程碑。成功筛选出大量抗体，有些已经进入临床实验阶段 噬菌体抗体库还可用于抗体分子定向进化的筛选 新型抗体库技术：选择性感染噬菌体展示抗体库技术 核糖体展示抗体库技术,4.6 抗体诊断试剂,抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的抗体试剂免疫标记技术用的抗体试剂体内导向诊断药物,一、血清学鉴定用的抗体试剂 血清学鉴定：用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌诊断和血型鉴定。基本原理：抗体与抗原之间的凝集反应,（1）鉴定病原菌用的抗体试剂 诊断血清,16

23、2种,（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂 灵敏度与酶免疫测定法相同，操作简便快速。（3）妊娠诊断试剂 检测血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素HCG。（4）抗ABO血型系统血清 红细胞表面存在A或B凝集原，鉴定血型,二、免疫标记技术用的抗体类试剂荧光抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂,（1）荧光抗体诊断试剂 荧光抗体:荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白而成。主要用于组织内或细胞内抗原物质的定位测定：用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，

24、达到诊断和定位目的。,直接法:荧光抗体直接与抗原反应，抗原鉴定、定位和分布。需要制备所需检测抗原的相应抗体。荧光CD单克隆抗体：白细胞分化抗原（表面标志）：CD（分化群，cluster of differentiation），按发现先后编号（1247）相应的CD抗原的荧光标记单克隆抗体用于细胞的鉴定、分离。间接法 标记抗免疫球蛋白抗体（二抗、抗抗体）标记一种抗体，可检测多种抗原抗体系统，灵敏度比直接法高510倍。根据一抗不同，二抗 种类不同：羊抗兔抗体、羊抗人抗体等。,（2）酶免疫测定用抗体诊断试剂 用酶标记抗体来检测抗原或抗体，酶的显色反应。常用酶：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP

25、)等。标记抗体：一抗或二抗 分类：免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定,免疫酶染色（组化法）用于组织内抗原物质的定位测定。酶标（辣根过氧化物酶，HRP）抗体与抗原发生特异性结合，HRP催化底物二氨基联苯胺（DAB）生成棕褐色沉淀物,标本的抗原部位显色，光学显微镜下观察。,酶免疫测定（定量测定溶液中抗原或抗体浓度）抗原抗体结合后，分离结合物，利用所标记酶将底物转化为有色产物，使用分光光度进行测定。,ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附试验）：抗原或抗体吸附于聚苯乙烯塑料表面，抗原抗体在塑料表面进行,非结合抗原或抗体容易洗去，简化抗原抗体结合物的

26、分离。ELISA灵敏度ng/ml 基本方法：夹心法、间接法、竞争法。,间接法（测抗体）夹心法（测多价抗原）,竞争法(可测单价抗原),生物素-亲和素放大ELISA(biotin-avidin system-ELISA，BAS-ELISA)生物素（维生素H）亲和素（avidin，碱性糖蛋白，鸡蛋清提取）链菌亲和素（streptavidin，链霉菌培养液提纯）亲和力:biotin-avidin 比抗原-抗体高1万倍,采用生物素化抗体替代酶标抗体一个抗体可结合90个生物素一个亲和素结合4个生物素生物素或亲和素与酶偶联灵敏度 pg/ml,HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂 HBeAg(乙型肝炎e

27、抗原)酶标诊断试剂 HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂 测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂,（3）放射免疫用抗体诊断试剂 抗体或抗原采用同位素标记，通过测定放射量测定浓度。常用125I 测定方法与ELISA相同（夹心法、间接法、竞争法），检测方法不同 灵敏度高pg/mlng/ml放射性对人有害，需防护措施标记物半衰期短 检测仪器昂贵,三、导向诊断药物 肿瘤放射免疫显像 抗肿瘤单抗（Ab）与 二乙基三胺五乙酸（DTPA）偶联成Ab-DTPA Ab-DTPA注入体内与肿瘤结合（3d）注入In-113(铟)，与DTP

28、A络合显像（2h）,4.7 抗体治疗药物,一、抗体封闭类抗体 与抗原结合，封闭抗原生物活性，阻断其与其他蛋白或配基作用。如：封闭各种细胞因子，破坏信号传导通路 效应杀伤类抗体 与抗原结合后，通过Fc片断介导的生物学功能清除或杀伤抗原物质（如肿瘤细胞、自身免疫细胞）,二、以抗体为载体的导向治疗药物导向载体：抗体、小分子抗体片断如scFv，Fab效应分子：放射性同位素、化学药物（化学偶联）细胞因子、毒素、酶（化学偶联或融合蛋白）1.放射性同位素标记抗体药物 I-131,Re-186或188(铼)，Bi-212(铋)等,效应分子：放射性同位素、化学药物（化学偶联）细胞因子、毒素、酶（化学偶联或融合蛋

29、白）2.抗癌药物偶联的抗体药物 常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、正定霉素(doxorubicin,DOX)等 3.毒素偶联或融合的抗体药物 细菌毒素：白喉毒素（DT）、绿脓杆菌外毒素（PE）、产气荚膜杆菌磷脂酶（PLC）植物毒素：蓖麻毒素（RT）、相思豆毒素（abric）,效应分子：放射性同位素、化学药物（化学偶联）细胞因子、毒素、酶（化学偶联或融合蛋白）4.细胞因子偶联或融合的抗体药物 常用细胞因子：IL-2、TNF、IFN等 5

30、.与药物代谢酶相连的抗体药物 抗体靶向的酶前体药物治疗（antibody directed enzyme prodrug therapy，ADEPT）将前体药物转化为活性分子6.双特异性抗体 一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端针对免疫活性细胞表面的效应分子，活化该免疫细胞,参考书：抗体工程药物.甄永苏 主编，化学工业出版社，2002,第四章 抗体制药什么是单克隆抗体？单克隆抗体有何不足？杂交瘤细胞技术中杂交瘤细胞HAT选择培养的原理是什么？简要了解单克隆抗体大量制备的方式。列出人源化抗体的种类，并简要说明其制备原理。了解小分子抗体的种类。写出双特异性单链抗体的构建方式。什么是抗体库技术？写出噬菌体抗体库技术的优点。噬菌体展示的基本原理，噬菌体展示过程中辅助噬菌体的作用。了解噬菌体抗体库的构建与筛选过程。什么是血清学鉴定，其基本原理是什么？免疫标记技术用的抗体类试剂有哪三种？ELISA 的基本方法有哪些？了解生物素-亲和素放大ELISA 画出抗体药物与其他药物的相互关系图。,