琼脂糖凝胶电泳原理 步骤 详细ppt课件.ppt

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1、http:/,李莉,琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,概述Introduction,Gel Electrophoresis：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。特点（characteristic）：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰4.适用于生化，免疫等定性定量测定,上海交通大学医学院,琼脂糖凝胶（Agarose Gel）,天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一

2、种线状高聚物。,琼脂糖（agarose）琼脂果胶（agaropectin）,Acid sulfateCarboxylic acid groups,上海交通大学医学院,D-半乳糖,3，6-脱水-L-半乳糖,琼脂糖（Agarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,琼脂糖凝胶的特点,（一）优点（advantage)1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色5.不吸收紫外光，可直接

3、利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性,上海交通大学医学院,（二）缺点(disadvantage)1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,琼脂糖凝胶电泳的应用Applications of Agarose Gel Electrophoresis,1.适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化2.临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测3.为不同类型的高脂蛋白血症、

4、冠心病等提供生化指标,上海交通大学医学院,The gel with UV illumination,the ethidium bromide stained DNA glows orange,上海交通大学医学院,Digital image of 3 plasmid restriction digests run on a 1%w/v agarose gel,3 Volts/cm,stained with ethidium bromide.The DNA size marker is a commercial 1kbp ladder.The position of the wells and d

5、irection of DNA migration is noted.,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,影响迁移率的因素Factors affecting migration,the size of the moleculeconformation of the molecule the agarose concentration of a gelVoltage,上海交通大学医学院,Percent agarose and resolution limits,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白,原理（Princip

6、le）血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。,上海交通大学医学院,(一)血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoBprotein：Apoprotein ApoC ApoD ApoE 甘油三酯（TG）脂类 磷脂（PL）游离胆固醇（FC）胆固醇酯（CE）少量糖,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,（二）分类1.按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM）-脂蛋白（-lipoprotein）前-脂蛋白（pre-lipoprotein）-脂蛋白（-lipoprotein）,上

7、海交通大学医学院,2.按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM)(0.94)极低密度脂蛋白(0.941.006)(very low density lipoprotein,VLDL)中间密度脂蛋白(1.0061.019)(intermediate density lipoprotein,IDL)低密度脂蛋白LDL(1.0191.063)(low density lipoprotein,LDL)高密度脂蛋白HDL(1.0631.21)(high density lipoprotein,HDL),上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,（三）结 构 特 征,上海交

8、通大学医学院,pH 8.6 pI，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前,上海交通大学医学院,加样槽 前,CM LDL VLDL HDL,+,上海交通大学医学院,临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM 前 正常型a型b型型型型,上海交通大学医学院,操 作,上海交通大学医学院,玻璃片,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,预染色的标本,上海交通大学医学院,上样处,玻片,琼脂糖凝胶,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,CM,上海交通大学医学院,正常参考值（百分比）-脂蛋白 30-40%前-脂蛋白 15%-脂蛋白 55%,注意事项：血清样品要新鲜为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清,上海交通大学医学院,名词解释1.迁移率2.电渗3.电泳问答题1.影响电泳迁移率的因素有哪些？2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。,复习思考题,上海交通大学医学院,参 考 书 目,临床生物化学及生物化学检验 第三版 人民卫生出版社 周新 主编电泳科学出版社 何忠效 张树政 主编蛋白质电泳实验技术 科学出版社 郭尧君蛋白质技术手册 科学出版社 汪家政 范敏 主编,