第二章中药化学成分的一般研究方法doc-第二章中药化学成.docx

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1、教学目的要求和内容第二章 中药有效成分研究的一般方法【目的要求】1. 掌握中药化学成分的类型、一般理化性质、提取、分离的一般方法。2. 了解中药化学成分生合成及结构鉴定的一般方法。【教学内容】1. 中药中所含各类化学成分及生合成简介。2. 提取中药有效成分常用的方法：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超声波提取法及超临界流体萃取法等。3. 分离中药有效成分常用的方法：系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、 沉淀法、盐析法、分馏法、结晶法及各种色谱法等。4. 中药有效成分结构研究方法简介：中药化学成分的结构鉴定程序、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱（一维谱：1H-NMR谱、13C-NMR谱、INEPT谱

2、、DEPT谱；二维谱：1H-1H COSY谱、HMQC谱、HMBC谱应用简介）、质谱（EI-MS、FD-MS、FAB-MS、MS/MS等）、旋光谱、圆二色谱等在中药化学成分结构研究中的应用及晶体X射线衍射法简介。【教学方法】课堂讲授。第二章 中药化学成分研究的一般方法（10学时） 第一节 中药化学成分及生物合成简介（1学时）第二节 中药有效成分的提取分离方法（6学时）第三节 中药有效成分化学结构的研究方法（3学时）第二章 中药化学成分的一般研究方法第一节 中药化学成分及生物合成简介一、 中药化学成分类型简介 (一) 糖类分为单糖类、低聚糖和多聚糖类及其衍生物。低聚糖通常是由29个分子的单糖脱水

3、缩合而成的化合物。多糖通常是由10个以上至上千个单糖脱水而形成的高聚物，水解后能生成相应数目的单糖。 (二) 苷类是糖或糖的衍生物与非糖物质(称为苷元或配基)通过糖的端基碳原子连接而成的化合物。 (三)醌类化合物是一类分子中具有醌式结构的化合物。包括苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌类化合物。(四) 苯丙素类化合物是一类分子中以苯丙基为基本骨架单位(C6-C3)构成的化合物。其中香豆素和木脂素为其典型化合物。 (五) 黄酮类化合物最早发现的黄酮为2苯基色原酮。泛指具有两个苯环通过中间三碳链相互联结而成的一类化合物。 (六) 萜类和挥发油凡由甲戊二羟酸衍生、且其基本母核的分子式符合(C5H8)n通式的衍生物

4、为萜类化合物。单萜和倍半萜类多为具有特殊香气的油状液体，在常温下可以挥发称挥发油或精油。(七) 生物碱 是一类存在于生物体内的含氮有机化合物，氮原子多结合在环内，具有碱的性质，能与酸结合成盐，具有显著的生理活性。 (八) 甾体类化合物 是一类结构中具有环戊烷骈多氢菲甾核的化合物。 (九) 三萜类化合物 是一类基本骨架由30个碳原子组成的萜类化合物。 (十) 鞣质 又称单宁或鞣酸，是一类复杂的多元酚类化合物的总称，可与蛋白质结合形成致密、柔韧、不易腐败又难透水的化合物。二、 各类中药化学成分的主要生物合成途径许多化合物在分子结构中都包含着某些基本组成单位。如苯丙素类化合物具有C6-C3单位，萜类

5、化合物具有重复的C5单位，脂肪酸、酚类、醌及聚酮类化合物具有C2单位，生物碱类化合物具有氨基酸单位，黄酮类化合物具有C6-C3-C6单位等等。按成分的生物合成途径可分为一次代谢产物和二次代谢产物。一次代谢产物是每种植物中普遍存在的维持有机体正常生存的必需物质，如叶绿素、糖类、蛋白质、脂类和核酸等。二次代谢是在特定的条件下，一些重要的一次代谢产物，如乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、莽草酸及一些氨基酸等作为前体或原料，进一步经历不同的代谢过程，生成生物碱、黄酮、萜类、皂苷等。因二次代谢产物具有特殊、显著的生理活性。因此成为中药化学的主要研究对象。中药二次代谢产物的主要生物合成途径如下。 （一） 乙酸

6、-丙二酸途径 (AA-MA途径) 通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。1. 脂肪酸类 乙酰辅酶A为这一生合成过程的起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。 乙酰辅酶A 丙二酸单酰辅酶A 缩合 乙酰乙酸 (acertoacetic acid) 还原 缩合 (Cn+2，n为偶数)图2-1 饱和脂肪酸的生物合成途径2酚类乙酰辅酶A直线聚合后再进行环合生成各种酚类化合物。 CH3-CO-S-CoA + 3 bCH3-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-Enz a c a b c 苔色酸 乙酰间苯三酚 四乙酸内酯 (间苯二酚型) (间苯三酚型) (内酯型)图2-2 酚类的生物

7、合成途径3醌类 多酮环合生成各种醌类化合物或聚酮类化合物。如中药决明子中部分有效成分的生物合成。 红镰刀菌素 决明内酯 Torachrysono大黄素甲醚图2-3 决明子部分成分的生物合成(二) 甲戊二羟酸途径（MVA途径） 这一途径生成萜类、甾类化合物。 甲戊二羟酸单酰辅酶A 乙酰乙酸辅酶A 甲戊二羟酸 MVA焦磷酸二甲烯丙酯（DMAPP） 焦磷酸异戊烯酯 （IPP） 甲戊二羟酸5焦磷酸 磷酸香叶酯 单萜 三萜类 甾体 焦磷酸金合欢内酯倍半萜类 反式角鲨烯 六氢番茄烃 焦磷酸香叶基香叶酯 类胡萝卜素二萜类 图2-4 甲戊二羟酸途径(三)莽草酸途径又称桂皮酸途径这一途径衍化生成具有C6-C3及

8、C6-C1基本结构的化合物。 去氢奎宁酸 去氢莽草酸赤藓糖4-磷酸 莽草酸 莽草酸3磷酸 分枝酸 苯丙氨酸 予苯酸 丝氨酸邻氨基苯甲酸 色氨酸 酪氨酸图2-5 莽草酸途径 -Oxidation 桂皮酸 对羟基桂皮酸 对羟基苯甲酸 香豆素 咖啡酸 原儿茶酸 阿魏酸 香草酸 木脂素 (C6-C3)2 芥子酸 丁香酸 图2-6 C6-C3，C6-C1 类天然产物生物合成途径(四) 氨基酸途径 大多数生物碱类成分由此途径生成。 多巴胺 Mannich反应 多巴 3,4-dihydroxyphenyl pyruvic acid ()网状番茄枝碱 ()网状番茄枝碱 全去甲劳丹诺苏林 (+)-salutar

9、idrine 小檗碱 罂粟碱Salutaridinol 蒂巴因 可待因 吗啡 莨菪碱 石榴皮碱 麦角酸鸟氨酸 赖氨酸 色氨酸图2-7 氨基酸途径(五)复合途径由不同的生物合成途径产生分子中的各个部分，即复合途径。如查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成。一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。图2-8 查耳酮、二氢黄酮生成的复合途径第二节 中药有效成分的提取分离方法中药有效成分的提取分离是研究中药化学成分的基础。这一过程一般应在生物活性或药理学指标跟踪下进行。 一、 中药有效成分的提取方法(一) 溶剂提取法溶剂提取法是根据被提取

10、成分的溶解性能，选用合适的溶剂和方法来提取。 作用原理是溶剂穿透入药材粉末的细胞膜，溶解溶质，形成细胞内外溶质浓度差，将溶质渗出细胞膜，达到提取目的。1溶剂的选择常用于中药成分提取的溶剂按极性由弱到强的顺序如下：石油醚四氯化碳苯二氯甲烷三氯甲烷乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇20个大气压)；中压液相色谱(MPLC，520个大气压)；低压液相色谱(LPLC，5个大气压)快速色谱(flash chromatography，约2个大气压)等。 第三节 中药有效成分化学结构的研究方法意义：为探讨有效成分的生物活性、构效关系、体内代谢以及进行结构改造、人工合成等研究提供必要的依据。前提：必须是单体化学成分

11、，这是鉴定化学结构的前提。纯度检验：平面色谱或柱色谱用两种以上溶剂系统或色谱条件进行检测，显示单一的斑点或谱峰，结晶样品的熔距为小于2，液体样品的沸程在5以内。一、中药有效成分的理化鉴定1物理常数的测定物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重等的测定。2分子式的确定目前最常用的是质谱法（MS）。高分辨质谱法（HR-MS）可给出化合物的精确分子量，查表得到化合物的几个可能分子式。也可通过质谱中出现的同位素峰的强度推定化合物的分子式。分子离子峰不稳定的化合物，难以用HR-MS测出，可用自动元素分析仪进行定性定量分析，得到一个化合物的实验式后，用场解吸质谱、快原子轰击质谱或制备衍生物再测定

12、其质谱等方法测定它的分子量，以求得化合物的分子式。3化合物的结构骨架与官能团的确定化合物不饱和度的计算，了解可能含有的双键数或环数。用化学法推定分子结构骨架主要依靠各类中药化学成分的呈色反应：如羟基蒽醌类化合物通过碱液显色反应（Borntrger反应）检识；黄酮类化合物可用盐酸镁粉反应、四氢硼钠还原反应等鉴定；强心苷类化合物可利用甾体母核、，-五元不饱和内酯环和-去氧糖的呈色反应结合化合物的理化性质，提取分离时的表现，综合考虑加以判断。二、中药有效成分的波谱测定1IR光谱化合物用量：510g；测定范围：在波数4000500cm-1间，其中1600cm-1以上为化合物的特征基团区，1000500

13、cm-1为指纹区。如果被测物结构基本已知，可能某一局部构型不同，在指纹区就会有差别，如25R与25S型螺甾烷型皂苷元，在980860cm-1附近有显著区别，很容易鉴别。2UV光谱 一般来说，UV光谱主要可提供分子中的共轭体系的结构信息，可据此判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。对某些具有共轭体系类型的中药有效成分，如蒽醌类、黄酮类以及强心苷类等成分的结构确定具有重要的应用价值。3NMR谱NMR谱是化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的原子核吸收一定的能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得之图谱。NMR谱能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、

14、周围化学环境、以及构型、构象的结构信息。随着超导核磁的普及，各种同核（如1H-1H、13C-13C）及异核（如1H-13C）二维相关谱的测试与解析技术等的开发应用日新月异，显示其重要性。（1）1H-NMR谱1H-NMR谱的化学位移()范围在020ppm。正常1H-NMR谱技术，能提供的结构信息参数，主要是化学位移()、偶合常数(J)及质子数。1H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现在不同区域，据此可以识别。偶合常数是磁不等同的两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分，其形状有二重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q

15、)及多重峰(m)等。裂分间的距离为偶合常数(J)。各种不同环境下1H核相邻结构具有一定的偶合常数值。除了正常1H-NMR谱技术外，还有一些帮助结构分析的辅助技术，如选择性去偶、重氢交换、加入反应试剂、各种双照射等。应用较多的双照射技术是核增益效应 (NOE)。NOE是在核磁共振中选择地照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子的信号强度增高的现象。它不但可以找出互相偶合的两个核的关系，还可以反映出不互相偶合，但空间距离较近的两个核间关系。如五味子酯甲的联苯双酯部分有二个芳氢，1H-NMR示二个单峰,值分别为6.76、6.43，这两个单峰的归属可用双照射的NOE技术予

16、以确定。照射3.64的甲氧基，发现位于6.76的芳氢峰增益l9%，照射另外三个甲氧基，均未见到NOE现象，故推测位于甲氧基邻位的芳氢值为6.76，位于亚甲二氧基邻位芳氢的值为6.43。 五味子酯甲（2） 13C-NMR谱 13C-NMR谱的化学位移范围为0250ppm，比1H-NMR谱大得多，是中药化学有效成分结构测定中最重要手段之一。13C-NMR谱提供的结构信息是分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移，异核偶合常数(JCH)及驰豫时间(T1)，其中利用度最高的是化学位移(c)。常见的13C-NMR测定技术如下。 质子宽带去偶： 也称质子噪音去偶或全氢去偶。此时H的偶合影响全部被消除，从

17、而简化了图谱。在分子中没有对称因素和不含F、P等元素时，每个碳原子都会给出一个单峰，互不重叠。因照射H后产生NOE现象，连有H的C信号强度增加。季碳信号因不连有H，表现为较弱的峰。 偏共振去偶： 在偏共振去偶谱中，每个连接质子的碳有残余裂分，故在所得图谱中次甲基(-CH)碳核呈双峰，亚甲基(-CH2)呈三重峰，甲基(-CH3)呈四重峰，季碳为单峰强度最低。由此可获得碳所连接的质子数、偶合情况等信息。 INEPT（低灵敏核极化转移增强法）：用调节弛豫时间()来调节CH、CH2、CH3信号的强度，从而有效地识别CH、CH2、CH3。当1/4（JCH）时, CH、CH2、CH3皆为正峰；当2/4（J

18、CH）时, 只有正的CH峰；当3/4（JCH）时, CH、CH3为正峰, CH2为负峰。由此可以区分CH、CH2和CH3信号。再与质子宽带去偶谱对照，还可以确定季碳信号。季碳因为没有极化转移条件，所以在INEPT谱中无信号。 DEPT（无畸变极化转移增强法）：是INEPT的一种改进方法。在DEPT法中，通过改变照射1H的脉冲宽度()，使为45o、90o、和135o变化并测定13C-NMR谱。所得结果与INEPT谱类似。当=45o时，所有的CH、CH2、CH3均显正信号；当=90o时，仅显示CH正信号；当=135o时，CH和CH3为正信号，而CH2为负信号。季碳同样无信号出现。图2-10、2-1

19、1、2-12分别为-紫罗兰酮质子宽带去偶谱，偏共振去偶谱及DEPT谱。图2-10-紫罗兰酮质子宽带去偶谱图2-11-紫罗兰酮偏共振去偶谱图2-12-紫罗兰酮DEPT谱(3) 二维核磁共振谱（2D-NMR谱） 二维化学位移相关谱(相关谱，简写为COSY)是2D-COSY谱中最重要、也是最常用的一种测试技术。2D-COSY谱又分为同核和异核相关谱两种。相关谱的二维坐标Fl和F2都表示化学位移。在中药有效成分结构研究中常用的相关谱类型如下。 同核化学位移相关谱 lH-1H COSY也称氢-氢化学位移相关谱，是同一个偶合体系中质子之间的偶合相关谱。可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。

20、图谱多以等高线图表示。对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合相关关系。例如，在化合物3,4-二羟基苯乙醇-8-O-D-葡萄糖苷的1H-1H COSY（图2-13）谱中可见苷元苯乙醇的7-H(2.65) 与8-H(3.90，3.65)有交叉峰。此外，在1H-1H COSY谱能找到葡萄糖基上氢与氢的偶合关系。 1H检测的异核化学位移相关谱 异核化学位移相关谱特别是13C-lH COSY谱，对于鉴定化合物的结构是十分重要的方法，常用的有HMQC谱和HMBC谱。HMQC谱是通过lH核检测的异核多量子相关谱(简称HMQC), 此谱能反映 lH核和与其直接相连的13C的关联关系，以确定C-H偶合关系（1JCH）。在HMQC谱中，Fl域为13C化学位移，F2域为lH化学位移。直接相连的13C与lH将在对应的13C和lH化学位移