核酸的化学ppt课件.ppt

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1、第一节 核酸的概念和化学组成 第二节 核酸的分子结构 第三节 核酸的理化性质 第四节 核酸的分离与含量测定,第五章 核酸的化学,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核酸(Nucleic Acid)是一类重要的含磷酸基团的生物大分子,担负着生命信息的储存与传递.核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域,是基因工程操作的核心分子.,第一节 核酸的概念和化学组成,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Ph

2、armacy of Yantai University,核酸与医药1）抗癌药物.如5氟尿嘧啶,6巯基嘌呤.2）基因工程药物,如胰岛素,白介素.3）基因治疗.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,一 核酸的研究历史1.核酸的研究历史1868年瑞士的Miescher测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,所有细胞的核里都含有此物质,命名核素(Nuclein);1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚核质中有 四种不同的组成部分:A,T,C,G;1

3、889年Altman制备了核酸并建议将核素改名为“核酸”,并且已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体;,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,1944年Avery的细菌转化实验证明DNA是遗传物质1950年Chargaff和Hotchkiss采用纸层析法分析DNA的组成,得知A=T,G=C,A+G=C+T1953年Watson,Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果,提出了DNA的双螺旋模型(Double helix)1970年发现第一个DNA限制性内切酶19

4、81年 Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1985年 Mullis发明PCR技术1990年开始实施人类基因组计划;2003年人类基因组计划宣告完成测序任务,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,2.DNA是主要的遗传物质1928年,英国细菌学家Griffith发现肺炎球菌:S型:有荚膜,菌落光滑,使小鼠死亡 R型:没有荚膜,菌落表面粗糙,无致死作用 美国微生物学家Avery做了著名的肺炎球菌转化实验.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Y

5、antai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,噬菌体试验进一步证明DNA是遗传物质.病毒仅含少量的DNA(或RNA)被一层蛋白质的外壳包裹.专门感染细菌的病毒称为噬菌体（bacteriophage）.,1952

6、年,Hershey和Chase的噬菌体实验证明：在病毒繁殖时DNA能复制并且控制新蛋白质外壳的合成.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,3.核酸的种类和分布核酸分为两大类：脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid，DNA核糖核酸 Ribonucleic Acid，RNA RNA主要存在于细胞质中,有3类tRNA,rRNA,mRNA,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy

7、 of Yantai University,核酸的基本结构单位-核苷酸（一）核苷和核苷酸核酸可以水解成核苷酸,核苷酸可以继续水解成磷酸和核苷,核苷可以水解成戊糖和碱基,碱基可以分成多种类型,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如5-氟尿嘧啶和6-巯基嘌呤就常用于治疗某些类型的癌症。,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University Scho

8、ol Pharmacy of Yantai University,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基.稀有碱基 的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物:,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核苷:由戊糖和碱基以C-N糖苷键连接而成,糖都是通过糖的异头碳和嘧啶的N-1或嘌呤的N-9之间形成的N-糖苷键与碱基连接,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai Universit

9、y,核苷酸:核苷+磷酸,核苷一磷酸可以进一步磷酸化,形成核苷二磷酸和核苷三磷酸,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核苷酸的命名:含一个磷酸基团：核苷一磷酸（NMP）含两个磷酸基团：核苷二磷酸（NDP）含三个磷酸基团：核苷三磷酸（NTP）N 代表各种碱基的名称,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（二）环化核苷酸 细胞信号转导途径中的第二信使

10、分子,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（三）辅酶类核苷酸：1.辅酶I(CoI,NAD）和辅酶II(CoII,NADP)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）在生物氧化过程中起到传递H的作用.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,2.黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在生物氧化过程中起到传递H的作用,烟台大学药学院 School Pharmacy of Y

11、antai University School Pharmacy of Yantai University,3.辅酶A（CoA CoA-SH）参与糖、脂、蛋白质的代谢过程,尤其在脂肪代谢过程中起重要作用,BACK,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,第二节 核酸的分子结构,一.DNA的分子结构（一）DNA的一级结构:多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH与另一分子核苷酸的5-磷酸基团形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物,烟台大学药学院 School Pharma

12、cy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,5-磷酸端（常用5-P表示）3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，表示一个多聚核苷酸链时,必须注明它的方向是53或是35,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核酸的一级结构：DNA的一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序(碱基的排列顺序).DNA 5-ATGCATGC3 RNA:5-AUGCAUGC3 3-TACGTACG3,

13、烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,一）DNA与基因基因(gene):是DNA片段的核苷酸序列,DNA分子中最小的功能单位.结构基因,调节基因.基因组(genome):某生物体所含全部遗传物质的总和.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,二）真核生物基因组特点2.回文结构：顺读到读序列一样,烟台大学药学院 School Pharmacy of

14、 Yantai University School Pharmacy of Yantai University,3.间隔顺序与插入顺序：内含子(intron):在真核生物细胞核中,DNA链上不能编码蛋白质的核苷酸片段,原核生物无.外显子(exon):DNA链上编码蛋白质的核苷酸片段.,组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,三）原核生物基因组特点1.有基因重叠现象功能相关基因串联在

15、一起,并转录在同一mRNA中（多顺反子）没有内含子结构,重复序列少,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（二）DNA的二级结构 DNA二级结构的Watson-Crick模型1.提出DNA双螺旋结构模型的根据（1）x-光衍射分析.Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA具有相似的X射线衍射图谱,从衍 射图推测出DNA的结构是一个螺旋结构.（2）DNA碱基组成的定量分析,20世纪40年代 chargaff规则：DNA碱基组成有种特异性,但无组织器官特异性 A=

16、T;G=C;A+G=T+C,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,2.Watson-Crick模型1953年,J.Watson和F.Crick提出了著名的DNA双螺旋结构模型,25岁,35岁,1962年沃森、克里克获得了诺贝尔医学和生理学奖,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,Watson-Crick模型结构要点：a）由两条反向平行的脱氧多核苷

17、酸单链围绕一中心轴（假想轴）构成右手双螺旋结构.两条链的走向为53和35.双螺旋表面形成两种槽:大沟和小沟.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,磷酸基团与脱氧核糖在外侧,彼此间以磷酸二酯键相连,构成的骨架.碱基在双螺旋内侧,双链中相对的碱基按-和-通过氢键配对连接,形成互补.当知道其中一条链的顺序可推测出另一条链的顺序.碱基平面与中心轴垂直,各相邻平面部分重叠.糖环平面与中心轴平行.双螺旋的直径为2nm,沿轴向每个碱基平面的距离为0.34nm,每圈螺旋含有10对核苷

18、酸，其轴向距为3.4nm.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,3 DNA 双螺旋结构的稳定因素主要靠三种作用力维持双螺旋的稳定：互补碱基之间的氢键.碱基堆积力.分子中碱基的堆积可以使碱基缔合.双螺结构稳定的主要作用力.离子键.磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的.不同条件下DNA形成的螺旋结构

19、不一样,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,4 左手螺旋模型（Z-DNA)1979美麻省理工A.Rich研究人工合成DNA d(CpGpCpGpCpGp)提出.但天然DNA中也存在,可能与基因表达调控和疾病有关,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（三）DNA的三级结构指双螺旋进一步扭曲形成的更高层次的空间结构原核生物没有典型的细胞核结构,超

20、螺旋结构被认为是原核生物的三级结构真核生物与组蛋白和非组蛋白结合组成核小体.核小体结构被认为是真核生物的三级结构,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,DNA 超 螺 旋 结 构,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,H2A、H2B、H3和H4各两分子组成组蛋白八聚体，构成核心组蛋白平均每200bp双螺旋DNA以左手超螺旋的方式绕核心组蛋白表面1

21、.75圈,构成核心颗粒核心颗粒和连接区DNA及附着在连接区DNA上的组蛋白H1构成核小体,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,二 RNA的种类和分子结构,主要有三类：1.核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)2.信使RNA(messenger RNA,mRNA)3.转运RNA(transfer

22、 RNA,tRNA)RNA的结构基本单位AMP GMP CMP UMP,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（一）信使RNA（mRNA）占细胞全部RNA的35%，是遗传信息的携带者,在细胞核中转录了DNA上的遗传信息,再进入细胞质,作为蛋白质合成的模板.mRNA分子量大小不一,数量多真核细胞中一般为单顺反子,一条mRNA编码一种蛋白原核细胞中一般为多顺反子,一条mRNA编码多种蛋白,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai Universit

23、y School Pharmacy of Yantai University,真核细胞m RNA的结构特点：3末端有一段约200个bp的poly A尾巴(1)免受核酸外切酶的作用(2)与翻译有关,没有polyA翻译活性降低(3)与mRNA从细胞核转移到细胞质有关5末端有7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸,称为帽子结构(m7GpppNm)(1)防止mRNA被核酸酶降解(2)为mRNA翻译活性所必需(3)与蛋白质合成的正确起始有关,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院

24、 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（二）转运RNA(tRNA)分子量最小一类RNA,占细胞全部RNA的15%,在蛋白质的合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给mRNA.（1）tRNA由7090个核苷酸组成,末端为-CCA-OH.每种氨基酸都有相应的tRNA（2）tRNA二级结构：呈三叶草式,由氨基酸臂、二氢尿咪啶环、反密码环和额外环组成（3）tRNA三级结构：呈倒写L形结构,由氨基酸臂 和TC环组成L的一横,二氢尿咪啶环、反密 码环和额外环组成L的一竖.,烟台大学药学院 Sc

25、hool Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,特点：1.四臂四环2.氨基酸臂3端有CCA-OH的共有结构3.D环上有二氢尿嘧啶（D）4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用5.可变环上的核苷酸数目可以变动6.TC环含有T和(假尿嘧啶）7.含有修饰碱基,tRNA的二级结构,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,tRNA的三级结构,烟台大学药学院 School Pharmac

26、y of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（三）核糖体RNA占细胞RNA总量的80%,与蛋白质共同组成核糖体，核糖体是进行蛋白质生物合成的场所.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,5S rRNA与tRNA二级结构相似呈三叶草结构.其它rRNA,尤其大的rRNA分子,存在许多双螺旋区和突环区组成的区域.,16S rRNA,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai U

27、niversity School Pharmacy of Yantai University,90年代初,Rich Jorgensen设想,将更多的色素基因注入植物体,能使花朵的色彩更艳丽,而结果出其预料,转基因的植株不仅没有新基因表达,反而使原有的色素基因也受到了抑制,当时称共抑制(cosuppression).,（四）RNAi,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,1995年,Guo S和kemphues等试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par-1基

28、因的表达.设计：反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达 正义RNA 以期观察到基因表达的增强.结果:二者都同样切断了par-1基因的表达途径.这与传统上对反义RNA技术的解释不相符合.该研究小组一直没能给这个意外以合理解释.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,RNAi的提出,1998年2月,Fire A和Mello C首次揭开这个悬疑.单链RNA注射线虫时发现,基因抑制效应十分微弱;而双链RNA却能高效特异性阻断相应基因的表达.他们证实,Guo S遇到的正义R

29、NA抑制基因表达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起.该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA interference,简称RNAi),烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,RNAi(RNA interference)是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pha

30、rmacy of Yantai University,RNAi广泛存在于自然界,随后,RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中.随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具,RNAi也越来越为人们所重视.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,第一步(起始阶段)是较长dsRNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA(small

31、 interfering RNA,siRNA)果蝇中的Rnase 样核酸酶称为Dicer,RNAi作用的简单模型,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,第二步(效应阶段)是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC).,RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成.活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA,

32、并在RISC中的核酸内切酶作用下切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA,而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA.新合成的

33、长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA.次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程,进一步放大RNAi作用.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,RNAi 的特点,转录后水平的基因沉默较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA.高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制.可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限,可传递给子一代.,烟台大学药学院 School Pharma

34、cy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,基因治疗：RNAi作用的高度特异性可特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常的等位基因.肿瘤的基因治疗：肿瘤是基因相互作用的基因网络调控异常的结果研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制特定的基因,获得功能丧失,因此可用于功能基因组的研究(类似Gene knock out).,RNAi技术的应用,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,防御病毒的

35、感染：RNAi具有对抗侵入性遗传因子(如病毒)的作用、打破其复制循环、减弱或消除其毒性作用.（五）微小RNA（miRNA）19-25nt的单链RNA,本身不编码任何蛋白，分布广,种类多.与靶mRNA的3UTR结合,阻止翻译进行.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,第三节 核酸的理化性质,一 核酸的分子大小,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University

36、,二 核酸的溶解度与粘度溶解度:DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂,微溶于水,但它们的钠盐在水中溶解度较大粘度：分子量越大粘度也越大:分子比分子小,粘度也就小,生物分子的空间结构也影响粘度:线形分子无规线团分子球形分子,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核酸的酸碱性为两性电解质,由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸,而碱性（氨基）是一个弱碱,所以核酸的等电点比较低.如DNA的等电点为44.5,RNA的等电点为22.5RNA的等电点比DNA低的原因:RNA分子中核

37、糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离.DNA没有这种作用.室温条件下,DNA在碱中变性但不水解,RNA水解,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,四 核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键,都能强烈吸收紫外光,最大吸收波长为260nm,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,1.紫外分光光度法检测核酸的纯度方法：通过测定波长在260nm和2

38、80nm处吸光度的比值(A260A280)来估计核酸样品的纯度 DNA溶液：A260A280=1.8 RNA溶液：A260A280=2.0若样品中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,2摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法,一般天然DNA(P)为6600,RNA为77007800增色效应:当核酸变性或降解时光吸收值显著增加减色效应:核酸复性后,光吸收值又回复到原有水平,烟台大学药学院 School

39、Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核酸的变性.复性和杂交1.DNA的变性(denaturation):在某些理化因素作用下,DNA分子内碱基对之间的氢键断裂,使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程.核酸一级结构(碱基顺序)保持不变.变性特征：生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素:加热pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School P

40、harmacy of Yantai University,解链温度（Tm）:使50%的DNA发生变性时的环境温度.简单常用的计算方法：Tm值4*(GC)2*(AT)如：ATGGTACATGACCTAGCTAAGC 其Tm=4*10+2*12=64,Tm值的大小主要与下列因素有关(1)DNA的均一性(2)G-C的相对含量:(G+C)%=(Tm-69.3)2.44(3)介质离子强度低,Tm低.(4)高pH下碱基去质子而丧失形成氢键的能力(5)变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键,妨碍碱基堆积,使Tm下降,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University Sc

41、hool Pharmacy of Yantai University,2.DNA的复性（renaturation)：在适当条件下,变性DNA的两条互补链再恢复成天然的双螺旋结构的过程.影响复性的因素:温度 低于Tm值25 最佳序列简单的分子复性快,如poly(dT)和poly(dA)DNA片段愈大,扩散速度愈低,复性慢离子强度有利于复性DNA浓度复性,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,3.核酸分子杂交（hybridiazation）：来源不同的两条单链核酸分子通过碱

42、基互补配对形成异源双链的过程.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,核酸分子杂交技术：用标记的核酸探针(已知序列)检测样品中未知的核酸序列的方法,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,探针:放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段,核酸分子杂交的应用：研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存

43、在与否是基因芯片技术的基础,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,常用的标记物：（一）放射性标记物：32P、3H、35S、14C、125I、131I特性：检测特异性强，灵敏度高不影响碱基配对的特异性和稳定性易造成放射性污染半衰期短，不能长时间存放检测：放射自显影检测杂交信号 放射线可以在X射线片上成影,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,（二）

44、非放射性标记物,常用的标记物：生物素（biotin）地高辛（digoxigenin）光生物素（photobiotin）优点：无环境污染，可较长时间贮存 缺点：灵敏度较放射性探针差,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,非放射性探针检测方法：,不能直接检测，分两步：偶联反应和显色反应偶联反应：利用抗原抗体反应,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,

45、核酸分子杂交技术,一、类型：根据反应环境分为1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。固体支持物种类：硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上,再进行杂交.-1975年英国E M Southern首创Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再

46、进行分子杂交.-1977年G.K.Stark首创,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,二.常用固相杂交类型,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,附：蛋白质的免疫印迹技术（weste

47、rn)待检分子：蛋白杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白所用抗体：1、一抗：针对待测分子的抗体2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,第四节 核酸的分离与含量测定,一.核酸的提取、分离和纯化（一）核酸

48、的分离、提取通则为了得到完整的大分子核酸,一般要注意3点:1保持低温（04）2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌 3防止核酸酶的作用,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,抑制DNase：可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂抑制RNase：（1）实验器皿高温,或高压灭菌,不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐(DEPC,diethyl pyrocarbonate)处理.（2）强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等（3）

49、核糖核酸酶阻抑蛋白(RNasin)等RNase的抑制剂,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,二.核酸含量测定的原理（一）定磷法RNA含P量为9.4；DNA含P量为9.9（二）定糖法（三）紫外吸收法在波长260nm紫外线下,吸光度为1.00时,相当于 50g/mL的双链DNA 40g/mL的单链DNA或RNA 20g/mL的单链寡核苷酸,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yan

50、tai University,（三）凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低,通过凝胶电泳:,（1）可进行核酸分离,知道核酸的纯度.,（2）测定分子大小.,（3）估计核酸的构象.,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University School Pharmacy of Yantai University,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关.,2聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide