标记抗体技术医学课件.ppt
《标记抗体技术医学课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《标记抗体技术医学课件.ppt(77页珍藏版)》请在三一办公上搜索。
1、标记抗体技术,1,编辑版ppt,标记抗体技术1编辑版ppt,抗原与抗体能特异性结合,但抗体、抗原分子小,在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。有一些物质即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出,如果将这些物质标记在抗体分子上,可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在,根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术,称为标记抗体技术(labeled antibody technique)。,2,编辑版ppt,抗原与抗体能特异性结合,但抗体、抗原分子小,,高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素3种,由此建立免疫荧光抗体技术、免疫酶标记技术和放射免疫分析。其特异性和敏感性
2、远远超过常规血清学方法,被广泛应用于病原微生物鉴定、传染病的诊断、分子生物学中的基因表达产物分析等各个领域。,3,编辑版ppt,3编辑版ppt,荧光素和荧光酶 发光器官主要靠两种物质产生光,一种叫荧光素,另一种叫荧光酶。当荧光素被一定波长的光激发时就会产生光,而荧光酶则是一种催化剂,它能帮助荧光素与氧结合产生氧化反应,同时产生光。深海动物发出的光是一种不发热的“冷光”,由于发光动物含有的荧光素和荧光酶不同,因此发出的光的颜色也不同,主要有橙、红、黄、绿、蓝、紫、白等颜色,但以蓝绿色光居多。,4,编辑版ppt,荧光素和荧光酶 发光器官主要靠两种物质产生光,一种,荧光素和荧光酶 大多数发光生物是通
3、过自己身体内的荧光素和荧光酶产生光,而少数发光生物则是依靠寄生在其发光器内的发光性细菌发光,例如有一种闪光鱼,在其发光器内寄生着上百亿个发光细菌。有些水母只能通过吃掉其他发光动物才能发光。,5,编辑版ppt,荧光素和荧光酶 大多数发光生物是通过自己身体内的荧,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。,四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保存。最大吸收光波长为 570nm,最大发射光波长为595600nm,呈现橘红色荧光。,
4、常见的荧光素,6,编辑版ppt,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocya,四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物,呈紫红色粉末,较稳定。最大吸收光波长为 550nm,最大发射光波长为620nm,呈现橙红色荧光,与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。,常见的荧光素,7,编辑版ppt,四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodami,藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE):PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素,红色荧光。,
5、酶作用后产生荧光的物质:某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。辣根过氧化物酶。蓝色,常见的荧光素,8,编辑版ppt,藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE):PE是在红,碘化丙啶(propidiumiodide,PI):可选择性地嵌入核酸(DNA、RNA)的双螺旋碱基对中。红色荧光,多甲藻叶绿素蛋白(peridinin chlorophyllprotein,PerCP):PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的,是一种蛋白复合物。深红色,常见的荧光素,9,编辑版ppt,碘化丙啶(propidiumiodide,PI):可选择性,生物学、化学和细胞学实验的特
6、殊试剂:藻蓝蛋白还是一种十分稀有的色素蛋白,具有荧光特性,当受光激发,可发出强烈的红色荧光,用于肿瘤和癌症的临床体外诊断上,对细胞的早期癌变诊断意义重大,可作为一种新型的光敏剂。,藻蓝蛋白,藻红蛋白,10,编辑版ppt,生物学、化学和细胞学实验的特殊试剂:藻蓝蛋白还是一种十分稀有,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,它们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488m,氦氖离子气体激光管发射光波长633m)。488m激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)
7、、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。,11,编辑版ppt,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,它们分子结构不同,激发,它们的激发光和发射光波长分别是:染料名激发光波长(m)发射光峰值(m)FITC 488 525(绿)PE 488 575(橙红)PI 488 630(橙红)ECD 488 610(红)CY5 488 675(深红)PreCP 488 675(深红),12,编辑版ppt,它们的激发光和发射光波长分别是:染料名激发光波长(,合适荧光素的选择:(1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。(2)荧光效率高,标记后下降不明显。(3)荧光色泽与背景色
8、泽对比鲜明。(4)标记后能保持生物学活性和免疫活性。(5)标记方法简单、快速。(6)安全无毒。,13,编辑版ppt,合适荧光素的选择:(1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。,免疫荧光抗体技术(immunofluorescence antibody technique)是指用荧光素对抗体或抗原进行标记,然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中,最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体,用于检测相应的抗原或抗体。,第1节 免疫荧光抗体技术,14,编辑版ppt,免疫荧光抗体技术(immunofluoresce,免疫荧光抗体标记技术最早是由Coons等于1941年建立的。当时是用异氰
9、酸荧光黄(fluorescein isocyanate,FIC)来标记抗体,用于检测小白鼠组织切片中可溶性肺炎球菌多糖。但由于FIC分子难于标记到抗体分子上,因而限制了该技术的推广和应用。直到后来发现异硫氰酸荧光素(FITC)和其他荧光素分子,以及荧光抗体纯化技术的发展,显著提高了荧光抗体标记技术的敏感性和特异性,才使这一技术在病原微生物的检测、传染病的诊断、肿瘤抗原研究等方面得到了广泛的应用。,15,编辑版ppt,免疫荧光抗体标记技术最早是由Coons等于194,系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis,SLE)患者血清中出现抗细胞核抗体(ANA)。以小白鼠肝
10、细胞核作为抗原基质,加病人血清(第一抗体),再加荧光标记的抗人IgG(第二抗体)进行间接免疫荧光试验,若患者血清中有ANA,即与肝细胞核抗原结合,再与荧光标记的抗人IgG结合,在荧光显镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。,16,编辑版ppt,系统性红斑狼疮(systemic lupus erythem,二、荧 光 素 荧光素是能够产生明显荧光,并能作为染料使用的有机化合物,又称为荧光色素。只有具备共轭键系统,即单键、双键交替的分子,才有可能使激发态保持相对稳定而发射荧光,具有此类结构的主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。,17,编辑版ppt,二、荧 光 素17编辑版ppt,二、荧
11、光 素 作为蛋白质标记用的荧光素尚须具备:有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团,而不形成有害产物;荧光效率高,与蛋白质结合的需要量很小;结合物在一般贮存条件下稳定,结合后不影响抗体的免疫活性;作为组织学标记,结合物的荧光必须与组织的自发荧光(背景颜色)有良好的反衬,以便能清晰地判断结果;结合程序简单,能制成直接应用的商品,可长期保存。,18,编辑版ppt,二、荧 光 素18编辑版ppt,可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC,其中应用最广的是FITC,罗丹明只是作为前者的补充,用作对比染色时标记。,19,编辑版ppt,
12、可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙,4种主要荧光素的化学结构,20,编辑版ppt,4种主要荧光素的化学结构20编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 1、标记要求:标本制作的要求首先是保持抗原的完整性,并尽可能减少形态变化,抗原位置保持不变。同时还必须使抗原-标记抗体复合物易于接受激发光源,以便良好地观察和记录。这就要求标本要相当薄,并要有适宜的固定处理方法。,21,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法21编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 2、标本处理方法:细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣等,可用涂片或压印片。组织学、细胞学和感染组
13、织主要采用冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。细胞培养可用胰酶消化后作成涂片。细胞或原虫悬液可直接用荧光抗体染色后,再转移至玻片上直接观察。,22,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法22编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 3、标本固定的目的:有两个目的,一是防止被检材料从玻片上脱落;二是消除抑制抗原抗体反应的因素(如脂肪)。检测细胞内的抗原,用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。最常用的固定剂为丙酮和95乙醇。固定后应随即用PBS反复冲洗,干后即可用于染色。,23,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法23编辑版ppt,(二)染色方法
14、荧光抗体染色法有多类,常用的有直接法和间接法。1、直接法:直接滴加2 4个单位的标记抗体于标本区,置湿盒中,于37染色30min左右,然后大量PBS(pH 7.07.2)中漂洗15min,干燥、封载即可镜检。直接法应设以下对照:标本自发荧光对照、阳性标本对照和阴性标本对照。直接法用于检测抗原,每检测一种抗原均需制备相应的荧光抗体。,24,编辑版ppt,(二)染色方法 荧光抗体染色法有多类,常用的有直接法和间接,2、间接法:将标本先滴加特异性的抗血清,置湿盒中,于37作用30min,漂洗后,再用标记的第2抗体(抗抗体)染色,漂洗、干燥、封载。对照除自发荧光、阳性和阴性对照外,间接法首次试验时应设
15、无中间层对照(标本+标记抗抗体)和阴性血清对照(中间层用阴性血清代替特异性抗血清)。既可用于检测抗原,又可用于检测抗体,而且制备一种荧光抗抗体即可用于同种属动物的多种抗原抗体系统的检测。,25,编辑版ppt,2、间接法:将标本先滴加特异性的抗血清,置湿盒中,于37,26,编辑版ppt,26编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用,(一)、细菌学诊断 利用免疫荧光抗体技术可直接检出或鉴定新分离的细菌,具有较高的敏感性和特异性。链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、布氏杆菌、炭疽杆菌等均可采用免疫荧光抗体染色进行检测和鉴定。粪便、黏膜拭子涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣等均可作为检测样本,经直接
16、法检出目的菌,具有很高的诊断价值。,27,编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用(一)、细菌学诊断 27编辑版pp,五、免疫荧光抗体技术的应用,(一)、细菌学诊断 对含菌量少的标本,可采用滤膜集菌法,然后直接在滤膜上进行免疫荧光染色,这一方法已在水的卫生细菌学调查、海水细菌动力学研究中得到应用。,28,编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用(一)、细菌学诊断 28编辑版pp,以较低浓度的荧光抗体加入培养基中,进行微量短期的玻片培养,于荧光显微镜下直接观察荧光集落的“荧光菌球法”,已广泛用于下痢粪便中的病原体检测。尤其对于已用药物治疗的患者,在病因学诊断上有较大价值,因为在这种情况下培养病原
17、体常难于成功。,五、免疫荧光抗体技术的应用,(一)、细菌学诊断,29,编辑版ppt,以较低浓度的荧光抗体加入培养基中,进行微量短期的玻片,免疫荧光抗抗体间接染色法检测抗体,可用于流行病学调查、早期诊断和现症诊断。如钩端螺旋体IgM抗体的检测,可作为早期诊断或近期感染的指征。用间接法检出结核分支杆菌的抗体,可以作为对结核病的活动性和化疗监控的重要手段。,五、免疫荧光抗体技术的应用,(一)、细菌学诊断,30,编辑版ppt,免疫荧光抗抗体间接染色法检测抗体,可用于流行病学调查,(二)病毒病诊断 用免疫荧光抗体技术直接检出患畜病变组织中的病毒,已成为病毒感染快速诊断的重要手段。一般可在2h内做出诊断报
18、告。病原的鉴别诊断。,五、免疫荧光抗体技术的应用,31,编辑版ppt,(二)病毒病诊断五、免疫荧光抗体技术的应用31编辑版ppt,(二)病毒病诊断 对含病毒较低的病理组织,需先在细胞培养上短期培养增殖后,再用荧光抗体检测病毒抗原,可提高检出率。某些病毒在细胞培养上不出现细胞病变,亦可应用免疫荧光作为病毒增殖的指征。应用间接免疫荧光染色法以检测血清中的病毒抗体,亦常作为诊断和流行病学调查之用,尤以IgM型抗体的检出可供早期诊断和作为近期感染的指征。,五、免疫荧光抗体技术的应用,32,编辑版ppt,(二)病毒病诊断五、免疫荧光抗体技术的应用32编辑版ppt,(三)其他方面的应用 免疫荧光抗体技术已
19、广泛应用于淋巴细胞CD分子和膜表面免疫球蛋白(mIg)的检测,从而为淋巴细胞的分类和亚型鉴定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清标记SPA荧光菌体作荧光SPA花环试验,可计算带有mIgM或mIgG的B细胞的百分率。,五、免疫荧光抗体技术的应用,33,编辑版ppt,(三)其他方面的应用 五、免疫荧光抗体技术的应用33编辑版,免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年,Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体,建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique),用于生物组织中抗原
20、的定位和鉴定。1971年,Engvall,VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验,从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代,基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前,免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。,第2节 免疫酶标记技术,34,编辑版ppt,免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后,一、原 理,酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂,催化反应过程中酶不被消耗,能反复作用,微量的酶即可导致大量的催化过程,如果产物为有色可见产物,则极为敏感。
21、其催化过程是:E+S(ES)E+P;或E+S(ES),(ES)+D1 E+P+D2式中:E为酶;S为酶作用底物;P为底物分解后的产物;D1 为供氢体,无色,底物水解时,D1由还原型变为氧化型D2,呈现颜色反应。,35,编辑版ppt,一、原 理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的,酶标抗体技术的基本程序是:将酶分子与抗原或抗体分子共价结合,既不改变抗体免疫活性,也不影响酶的催化活性;将酶标抗体(抗抗体)与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原(抗体)发生特异性结合,并洗下未结合的物质;滴加底物溶液后,底物在酶作用下水解呈色;或者底物不呈色,但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子,使供氢体由无色
22、的还原型变为有色的氧化型,呈现颜色反应。,36,编辑版ppt,酶标抗体技术的基本程序是:36编辑版ppt,可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗原(抗体)的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到,或用分光光度计加以测定。这样,就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,用以在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克、纳克水平上测定它们的量。本法既特异又敏感,是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。,37,编辑版ppt,可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应,二、用于标记的酶,用于标记的酶
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 标记 抗体 技术 医学 课件
![提示](https://www.31ppt.com/images/bang_tan.gif)
链接地址:https://www.31ppt.com/p-2081814.html