五子衍宗方主要药效学成分.docx

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1、五子衍宗方主要药效学成分药代动力学方法研究项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心项目完成人： 马 辰 五子衍宗方为中药经典古方，源自唐代悬解录。其功用主治为补肾益精，用于治疗肾虚腰痛，尿后余沥，以及不孕不育症等。中国药典以成方制剂五子衍宗丸形式收载，其处方组成为：菟丝子400g、枸杞子400g、覆盆子200g、车前子100g和五味子50g。在五子衍宗方中菟丝子和枸杞子为方中的君药。目前中国药典对五子衍宗丸仅有性状和定性鉴别，未有含量测定。 菟丝子为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam. 的干燥成熟种子，为常用中药，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等作用，其中

2、黄酮类化合物为主要成分。目前从菟丝子中提取并鉴定出结构的黄酮类成分有金丝桃苷、槲皮素、紫云英苷、山奈酚等。目前中国药典2000版一部中，未对菟丝子进行含量测定。菟丝子中含有的主要化学成分以槲皮素及其苷为主，其中金丝桃苷为含量较高的槲皮素苷，因此对菟丝子和五子衍宗方进行含量测定时，以金丝桃苷为指标成分，其理化性质及结构如下： 物理性状：淡黄色针状结晶（乙醇），熔点227230（237239分解），比旋度20D=-83。（C=0.2吡啶），易溶于甲醇、乙醇、丙酮及吡啶。 金丝桃苷化学结构：一、五子衍宗方及菟丝子中金丝桃苷的含量测定1 实验材料及仪器设备1.1 药品及试剂 金丝桃苷对照品：本所植化室

3、提供，纯度达95%以上 五子衍宗方药材（菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子）：北京同仁堂药店磷酸（分析纯）； 无水乙醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；Fisher甲醇：（色谱纯）；双蒸水 1.2仪器设备 Waters 2690高效液相色谱仪及996-二极管阵列检测器，Millennium32色谱软件，有机相微孔滤膜（0.45m）针头滤器，BUCHI 461电热恒温水浴箱2 色谱条件选择菟丝子及五子衍宗方中黄酮类成分较多，其中菟丝子中以槲皮素及其苷为主，五子衍宗方中除菟丝子含有黄酮类成分外，车钱子中也含有车钱苷等黄酮类成分。参考文献对菟丝子及五子衍宗中的金丝桃苷测定的色谱条件进行了优选。2.1检测

4、波长的选择从金丝桃苷的紫外光谱Fig. 1可见，其在254nm和355nm均有较大的吸收，文献中多以355nm作为对金丝桃苷的检测波长，主要考虑其它干扰成分在此吸收较低。因此本论文对菟丝子中含量测定时，首先考虑了355nm作为检测波长，而对五子衍宗方进行含量测定时，其他成分对主峰有干扰，而主要干扰成分在254nm却有较低的吸收，并与主峰能实现基线分离。因此对五子衍宗方中的金丝桃苷进行含量测定时选用了254nm。图1 金丝桃苷甲醇溶液的紫外光谱2.2流动相的选择 首先以流动相甲醇0.5%磷酸（50：50，用三乙胺调pH至3.0），实验中发现柱效下降很快，分析认为使用三乙胺调pH，对色谱柱的损害太

5、大。考虑到常规C18色谱柱的酸性适用范围，在上述流动相基础上分别考察了0.5%醋酸、0.05%三氟乙酸以及0.1%磷酸，从保留时间、分离度和拖尾因子角度进行评价，优选了最佳的流动相组成。最终确定甲醇：乙腈：0.1%磷酸 ( 40:5:55)作为金丝桃苷流动相条件。2.3色谱条件色谱柱：Alltech C18柱（5m，250mm4.6mm i.d） 流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55） 流速：0.8mL/min，柱温：25，检测波长：355nm（菟丝子含量）；254nm（五子衍宗方含量）3 实验溶液制备3.1对照品溶液的配制精密称取金丝桃苷标准品10mg置于10mL的容量瓶中

6、，加入甲醇溶解并稀释至刻度，备用。精确量取上述金丝桃苷溶液2mL于10ml容量瓶中，配成200g/mL的标准溶液。色谱图见Fig. 2（355nm）和Fig. 3（254nm）。图2 金丝桃苷的HPLC图（355nm检测）图3 金丝桃苷的HPLC图（254nm检测） 3.2菟丝子供试品溶液制备3.2.1提取方法考察（1）提取溶剂的选择取菟丝子粉6份（过40目筛）各0.4g，精密称定，置150mL三角瓶中，分别精密加入甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，即得，进样10L，计算提取药材含量

7、。结果见表Tab.1，实验数据表明以上溶剂中60%乙醇对金丝桃苷的提取率最高。表1 对菟丝子提取溶剂的比较表SolventMeOH40%EtOH50%EtOH60%EtOH80%EtOH95%EtOHsample weight(g)0.40070.40060.40130.39910.40170.4002Content(%)0.3420.3500.3520.3650.3530.297（2）提取时间的比较 精密称取菟丝子粉4份各0.4g，加入50mL 60乙醇，称重，加热回流，分别提取0.5、1、2、3、4h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，即得，进样10L，计算提取药材含量。结果见

8、表Tab.2，实验数据表明热回流提取2h已经将菟丝子中的金丝桃苷提取完全。表2 对菟丝子提取时间的比较Time0.5h1h2h3h4hsample weight(g)0.39930.40120.40060.40090.4006Content(%)0.3150.3130.3220.3180.311（3）溶剂用量比较 精密称取菟丝子粉3份各0.4g，分别加入35、50、60mL 60乙醇，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，即得，进样10L，计算药材含量。结果见表Tab.3。其中50mL溶剂即能提取完全表3 对菟丝子提取溶剂体积的比较Volume35mL50ml6

9、0mLsample weight(g)0.39950.40790.4008Content(%)0.4100.4110.3523.2.2菟丝子供试品溶液制备根据上述条件选择确定确定菟丝子提取方法为：取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g，精密称定，置150mL三角瓶中，精密加入60%乙醇50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，即得，进样10L。色谱图见Fig. 4图4 菟丝子60%乙醇提取液的HPLC图（355nm）3.3五子衍宗方供试品溶液制备3.3.1五子衍宗方提取方法考察（1）提取溶剂的选择按处方比例精密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g

10、、车钱子0.1g和五味子0.05g，以上药材均为细粉（过40目筛）4份，分别精密加入甲醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，各进样10L，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.4，表明60%乙醇对五子衍宗方中金丝桃苷的提取率最高。表4 五子衍宗方提取溶剂的比较SolventMeOH50%EtOH60%EtOH80%EtOHsample weight （g）1.1631.1661.1621.166content （）0.1130.1060.1150.113（2）提取时间 按处方比例精密称取五子衍宗方1.1

11、5g，加入50mL 60乙醇，称重，加热回流，分别提取1、2、3、4h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，各进样10L，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.5，实验数据表明热回流提取2.0h已经将五子衍宗方中的金丝桃苷提取完全。表5 五子衍宗方提取时间的比较Time1h2h3h4hsample weight（g）1.1611.1571.161.162Content()0.1170.1190.1180.115（3）溶剂用量比较按处方比例精密称取五子衍宗方1.15g，分别加入35、50、60mL 60乙醇，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，各进样10

12、L，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.6。其中50mL溶剂即能将复方中的金丝桃苷提取完全。表6 五子衍宗方提取溶剂体积的比较Volume （mL)35mL50ml60mLsample weight （g）1.1641.1611.159Content （）0.1120.1140.1143.3.2五子衍宗方供试品制备根据上述条件选择，确定五子衍宗方中金丝桃苷的提取方法为：按处方比例精密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、车钱子0.1g和五味子0.05g，以上药材均为细粉（过40目筛）。精密加入60%乙醇50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤

13、，即得。色谱图见Fig. 5（254nm）和Fig. 7（355nm），缺菟丝子药材的色谱图见 Fig. 6（254nm）和Fig. 8（355nm）。从色谱图可以看到，在355nm处干扰组分的色谱峰与金丝桃苷主峰未能完全分离，在254nm处，由于干扰峰吸收较低，对金丝桃苷主峰的影响不大。图5 五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（254nm）图6 缺菟丝子的五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（254nm） 图7 五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（355nm）表8 金丝桃苷的精密度(n=5)4 方法学考察4.1标准曲线的建立 精确量取1mL 200g/mL的金丝桃苷标准溶液，分别置

14、于25mL、20mL、10mL、5mL和2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成一系列的标准品溶液，依“色谱条件”分离，取10L标准溶液进样。以标准液浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，标准曲线见Fig. 9。计算得回归方程为Y=25590.84C-3511.23，相关系数R=0.9999，线性范围为8.13203.20g/mL。表9 菟丝子测定精密度4.2 最小检出限以信噪比（S/N）大于3测得金丝桃苷的最小检出限，测定结果见表Tab.7表7 金丝桃苷的检测限Hyperoside254nm355nmDetection limits (ng)1.361.744.3 精密度试

15、验配制高、中、低浓度的金丝桃苷对照品溶液（浓度分别为203.20g/mL，20.32g/mL，8.13g/mL），进样10L，连续进样5次，测得峰面积，金丝桃苷不同浓度的相对标准偏差在0.521.96之间。结果见表Tab.8表8 金丝桃苷的精密度(n=5)Concentration8.13g/mL20.32g/ mL203.20g/mLPeak area19876751290251747552070955056335109594203905505746514063319999252609551229322067975253165160806203311.2515138.45141744SD38

16、23.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525 菟丝子中金丝桃苷含量的测定5.1菟丝子供试品精密度实验取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g，精密称定，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积。结果见表Tab.9，其RSD为0.91%。表9 菟丝子测定精密度Peak area886810891043883854874905872011Average area881724.6SD8032.57RSD%0.915.2 重复性实验取同一批菟丝子样品，精密称取0.4g，共5份，各按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项下制备，各进样10L

17、，求算含量。结果见表Tab.10。其RSD为0.76%表10 菟丝子测定重复性 Sample12345Sample weigh(g)0.40120.40660.40220.40800.3991Content(%)0.4130.4190.4110.4150.416Average content0.415SDRSD%0.003160.765.3 稳定性实验 取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g，精密称定，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，分别在2、4、6、8、10、12h连续进样，测得峰面积。结果见表Tab.11，其RSD为1.29%，表明菟丝子供试品在测定时间12h内保持稳定

18、。表11 菟丝子提取液的稳定性Time（h)24681012Peak area887410895655881845863950871081879336Average area879879.5SD11321.63RSD%1.295.4 回收率实验精密称取已测定含量的菟丝子粉9份，各 0.4g，随机分成3组，分别精密加入金丝桃苷对照品溶液（1.4mg/mL）1.2、1、0.8ml，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项下制备，各进样10L依色谱条件下进行测定。结果见表Tab.12，高、中、低加入量的平均回收率为98.8-100.0。 加入标准品后测得量（）样品含量（）回收率（） 100 加入标准品

19、量表12 菟丝子中金丝桃苷的测定回收率Volume(mL)Sample weight(g)Amount in sample(mg)Amount added(mg)Total amount determined(mg)Recovery(%)Average(%)0.40131.681.122.81101.010.8(n=3)0.40651.701.122.82100.02100.00.40381.691.122.8099.070.40011.671.403.0699.291.0(n=3)0.40101.711.403.13101.0299.60.40211.681.403.0698.590.409

20、01.691.683.3397.611.2(n=3)0.40791.711.683.3798.7798.80.40861.711.683.39100.035.5 菟丝子样品测定采用外标法，每次实验以随行标准计算含量，计算公式如下： MrAi菟丝子中金丝桃苷的含量（） 100%MArMr： 标准物质的量（g）Ar： 标准物质峰面积M: 菟丝子样品重量（g）Ai： 样品中成分金丝桃苷的峰面积精密称取菟丝子粉6份各0.4g ，按“菟丝子供试品溶液制备”项下操作。各进样10L，按外标法计算含量。菟丝子结果见表Tab.13，菟丝子中金丝桃苷的平均含量为0.419%（g/g），RSD为2.98%。表13

21、菟丝子中金丝桃苷的含量测定结果(n=6)Sample123456Sample weigh(g)0.40030.40800.40690.40820.40400.4008Content（）0.4140.4170.4190.4110.4440.411Average content（）0.419RSD%2.986. 五子衍宗方中金丝桃苷含量的测定6.1五子衍宗方供试品精密度实验按处方比例精密称取五子衍宗方样品1.15g，按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积。结果见表Tab.14，其RSD为0.32% 表14 五子衍宗方测定精密度Peak area1028

22、9441020762102298610223661021543Average area1023320SD3253.93RSD%0.326.2五子衍宗方供试品重复性实验 按处方比例，精密称取五子衍宗方样品1.15g，共5份，按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项下制备，各进样10L，求算含量。结果见表Tab.15。其RSD为1.43%.表15 五子衍宗方测定重复性sample12345sample weigh（g）1.15431.15651.15691.15591.1612Content（）0.1160.1170.1140.1140.113Average content（）0.115RSD%

23、1.436.3五子衍宗方供试品稳定性实验按处方比例精密称取五子衍宗方样品1.15g，按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，分别在2、4、6、8、10、12连续进样，测得峰面积。结果见表Tab.16，其RSD为0.55%，表明五子衍宗方供试品中测定时间12h内保持稳定。表16 五子衍宗方测定溶液稳定性Time（h）24681012Peak area102981810128101023534101994910232651024561Average1022323SD5651.03RSD%0.556.4 回收率实验按处方比例精密称取五子衍宗方样品1.15g，共9份，随机分成3组，

24、分别精密加入金丝桃苷对照品溶液（1.414mg/mL）1.2、1.0、0.8ml，按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项下制备，各进样10L依色谱条件下进行测定。按下列公式计算，结果见表Tab.17，高、中、低加入量的平均回收率为99.2-102.7。 加入标准品后测得量（）样品含量（）回收率（） 100 加入标准品量表17 五子衍宗方中金丝桃苷的测定回收率Volume(mL)Sample weight(g)Amount in sample(mg)Amount added(mg)Total amount determined(mg)Recovery(%)Average(%)1.1511.6

25、851.1312.864104.10.8(n=3)1.1531.6801.1312.848102.7102.71.1481.6861.1312.824101.21.1531.6891.4143.09399.31(n=3)1.1551.6821.4143.136103.4101.11.1511.6901.4143.118100.61.1581.6931.6973.431102.31.2(n=3)1.1541.6781.6973.37299.599.21.1501.6771.6973.30195.76.5 五子衍宗方的样品测定 同“5.5 菟丝子样品测定”项，亦采用外标法，每次实验以随行标准计算含

26、量，计算公式如下： MrAi复方中金丝桃苷的含量（） 100%MAr式中：Mr-标准物质的量（g）；Ar- 标准物质峰面积；M-五子衍宗方样品重量（g）；Ai-样品中成分金丝桃苷的峰面积按处方比例精密称取6份各1.15g ，按“五子衍宗方供试品溶液制备”项下操作。各进样10L，按外标法计算含量。结果见表Tab. 18，在五子衍宗方中金丝桃苷的平均含量为0.116%（g/g），RSD为1.76。表18 五子衍宗方中金丝桃苷含量测定结果Sample123456Sample weight（g）1.15501.15751.15491.15511.16081.1613Content（）0.1170.11

27、90.1150.1150.1160.113Average content（）0.116RSD%1.76二、菟丝子及五子衍宗方大鼠血浆药代动力学研究本研究通过建立RP-HPLC法，以金丝桃苷为指标成分，对五子衍宗方药代动力学进行了可行性研究。测定了五子衍宗方80乙醇提取物，菟丝子80乙醇提取物，及纯品金丝桃苷大鼠腹腔给药后，不同时间的血浆药物浓度。并以中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P87软件处理时间平均血药浓度数据，以拟合优度（goodness of fit）和AIC判断曲线拟和程度，选择房室模型，计算得到了药代动力学参数。1 实验材料及仪器设备1.1 药品及试剂 金丝桃苷对照品 本所植

28、化室提供，纯度达95%以上五子衍宗方药材 （菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子） 购自北京同仁堂药店无水乙醇（分析纯） 北京化工厂肝素钠 常州新华活性材料研究所 磷酸（分析纯） 北京化工厂丙二醇（分析纯） 北京化工厂乙腈（色谱纯） Fisher公司产品；甲醇（色谱纯） 江苏淮安塑料制品厂；双蒸水 北京协和药厂；氯化钠注射液 石家庄制药集团。1.2 动物 Wistar 雄性大鼠 200-220g，购自中国药品生物制品检定所动物中心，许可证编号：SCXK11-00-00101.3仪器设备Waters 2690高效液相色谱仪及996-PDA型检测器，北京医用离心机厂制造的LD5-2A离心机，江苏医

29、疗器械厂制造的液体快速混合器，微量移液器（20-200mL,德国Fisherbrand）2色谱条件的选择2.1检测波长的选择 根据金丝桃苷的紫外吸收，对254nm和355nm两波长进行了考察。实验中发现，在254nm下，血浆中的内源性物质对金丝桃苷有较强的干扰作用。在五子衍宗方中测定金丝桃苷含量时采用了254nm，目的是消除其他组分的干扰，但在大鼠腹腔注射五子衍宗方乙醇提取物后取得的血浆样品中，由于复方的干扰组分进入血浆中含量较低，对血浆中金丝桃苷主峰未有影响，而内源性物质在254nm下确对主峰干扰较大，因此在五子衍宗方药代动力学研究中亦选取355nm作为检测波长。2.2流动相的选择 参考“第

30、二章 菟丝子及五子衍宗方金丝桃苷含量的测定”中优选的流动相条件，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）为流动相，对金丝桃苷纯品、菟丝子乙醇提取物和五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔给药后血浆中金丝桃苷的色谱条件进行了考察。实验发现，大鼠腹腔注射五子衍宗方提取物的血浆样品，在给药40min后出现代谢产物，在上述流动相条件下，与金丝桃苷不能实现基线分离，因此在原流动相甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）基础上，进行了流动相比例的调整，其中在甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：14：70）流动相下，金丝桃苷与五子衍宗方中的代谢产物成分实现基线分离。色谱图见Fig.10和Fig.1

31、1。图10 Wistar大鼠腹腔注射菟丝子80%乙醇提取物40分后血浆的HPLC图tR=10.86min 金丝桃苷（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）图11 Wistar大鼠腹腔注射五子衍宗方80%乙醇提取物40分后血浆的HPLC图tR=15.31min 金丝桃苷（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸16：14：70）2.3内标的选择 根据内标选择的原则，选择理化性质与金丝桃苷相近的化合物。对野黄芩苷、芦丁等20多种物质进行了测试，未找到符合条件的内标物。曾经泽在生物药物分析中指出，一定要明确不是所有内标法都能提高分析结果的精密度，在某些情况下，如样品沉淀蛋白后直接进样、柱切换进样，外标

32、法反而比内标法好且省事，即使样品经萃取处理，如内标选择不合适，同样外标法会比内标法好。由于未找到合适的内标，样品处理又采用甲醇沉淀蛋白后直接进样，在这种情况下本论文采用外标法进行定量计算。2.4 色谱条件 根据“2.1检测波长的选择”和“2.2流动相的选择”项下筛选的波长和流动相，对金丝桃苷纯品、菟丝子提取物和五子衍宗方提取物大鼠腹腔给药后的血浆样品分别采取的色谱条件如下：色谱柱：Alltech C18柱（5m，250mm4.6mm i.d）流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）适用于金丝桃苷和菟丝子乙醇提取物大鼠腹腔给药的药代动力学研究。流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶

33、液（16：14：70）适用于五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔给药的药代动力学研究。流速： 0.8mL/min，检测波长355nm。在上述色谱条件下，空白血浆、空白血浆加金丝桃苷标准品和大鼠腹腔给药金丝桃苷纯品及菟丝子提取物腹腔给药和五子衍宗方提取物灌胃给药的HPLC谱图如Fig.12，Fig.13（流动相） ，Fig.14（流动相），Fig.15，Fig.16和Fig.11所示。结果显示金丝桃苷纯品，以及菟丝子提取物和五子衍宗方提取物中的色谱峰均不受内源性杂质峰的干扰，测定的专属性强。图12 HPLC图图13 空白血浆加金丝桃苷的HPLC-DAD图tR=15.44min 金丝桃苷（流动相：甲醇乙腈

34、-0.1%磷酸16：14：70）图14空白血浆加金丝桃苷的HPLC-DAD图tR=10.80min 金丝桃苷（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）图15 Wistar大鼠腹腔注射金丝桃苷40分后血浆的HPLC- DAD图（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）图16 Wistar大鼠腹腔注射菟丝子80%乙醇提取物40分后血浆的HPLC-DAD图（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）3 血浆样品预处理方法的选择3.1 提取条件及提取溶剂选择 采用蛋白沉淀试剂沉淀血浆蛋白，过滤后直接进样和混合溶剂（含蛋白沉淀剂）沉淀蛋白，上清液吹干复溶进样比较。（1） 沉淀蛋白过滤后直

35、接进样蛋白沉淀试剂选择对金丝桃苷溶解性较好的甲醇、乙醇、丙酮和乙腈。提取方法为：以含有金丝桃苷 1.0g/mL溶液0.1mL为待提取液（加入空白血浆0.2mL），加入0.5mL溶剂，涡流震荡1min。超声提取10min，3000转/min离心10min(分离有机相中的蛋白)，取上清液，微孔滤膜过滤，进样30l。所测得金丝桃苷色谱峰面积，与标准溶液直接进样分析所得峰面积值对比，提取率见表19。表19 不同蛋白沉淀试剂对金丝桃苷的提取率Deproteined SolventCH3OHC2H5OHCH3COCH3CH3CNExtract percent(%)71653534（2） 上清液吹干复溶进样

36、 考察了甲醇和乙酸乙酯混合溶剂沉淀蛋白后氮气吹干，残渣复溶进样，比较了甲醇与乙酸乙酯2:1，1:1和1:2不同比例下的提取率。 提取方法为：以含有金丝桃苷 1.0g/mL溶液0.1mL为待提取液（加入空白血浆0.2mL），加入3ml溶剂，涡流震荡1min，3000转/min离心10min，取上清液，氮气吹干溶剂，残渣用500l甲醇复溶，微孔滤膜过滤，进样30l。所测得金丝桃苷色谱峰面积，与标准溶液直接进样分析所得峰面积值对比。提取率见表20。表20 不同比例甲醇-乙酸乙酯混合溶剂对血浆中金丝桃苷的提取率比较Extract solvent（MeOH：EtOAc）2: 11: 11: 2Extra

37、ct percent(%)676054综合比较两种方法，甲醇沉淀蛋白后直接进样，方法简单，回收率相对较高，因此以其作为血浆中金丝桃苷的提取方法。3.2血浆样品处理根据“3.1 提取条件及提取溶剂”项下，血浆样品的处理方法为：取大鼠血浆0.2mL，置于0.5mL Epphendorf 塑料管中，加入甲醇溶液0.3mL，涡流振荡3min，混匀，离心10min（3000转/min），取上层溶液，用0.45m微孔针头滤器过滤，取滤液30L进行HPLC分析。4 方法学考察4.1 标准曲线与线性范围 取大鼠空白血浆0.2mL，置于1mL Epphendorf塑料管中，加入金丝桃苷系列标准溶液300L，分别

38、配制成相当于浓度为0.30，0.60，1.20，1.50，3.00，6.00和15.00g/mL的血浆样品，按照“3.2.血浆样品处理”项下操作，建立标准曲线。以血浆中待测物浓度（C）为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，进行回归计算，求得直线回归方程，建立标准曲线。以流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55），计算得到的回归方程为Y=27436.38C4300.45，R=0.9997，标准曲线见Fig.17，线性范围在0.30-15.00g/mL。以流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：14：70），计算得到的回归方程为Y=21242.47C3721.16，R=0.9985

39、，标准曲线见Fig.18。上述方法在0.30-15.00g/mL范围内线性良好，为减少日间误差，测定样品时，均做随行标准。图17 血浆中金丝桃苷测定标准曲线（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）图18 血浆中金丝桃苷测定标准曲线（流动相：甲醇乙腈-0.1%磷酸16：14：70）4.2 最低检测限以信噪比（S/N）大于3，以两种流动相条件测得金丝桃苷在血浆中的最低检测浓度均为为0.30g/mL。4.3 绝对萃取率实验取金丝桃苷标准溶液0.4、1.0和10.0g/mL三个浓度各300L(平行做三个)，加入5mL具塞离心管中，各加入200L空白血浆，其它按“3.2血浆样品处理”项下操作，所

40、测得金丝桃苷的色谱峰面积值，与标准溶液直接进样分析所得峰面积值对比，求得各浓度点的平均绝对萃取率。见表Tab.22表22 不同浓度的绝对萃取率ConcentrationExtraction percent(%)MeanRSD(%)0.4g/ml60.862.168.863.96.711g/ml69.373.968.570.64.1210g/ml79.282.276.679.33.534.4精密度试验配制高、中、低浓度的金丝桃苷对照品溶液（浓度分别为200g/mL，20g/mL，8g/mL），进样10L，连续进样5次，测得峰面积，金丝桃苷不同浓度的相对标准偏差在0.521.96之间。结果见表Ta

41、b.23.表23 HPLC法测定血浆中金丝桃苷的精密度(n=5)Concentration8g/mL20g/ mL200g/mLPeak area19876751290251747552070955056335109594203905505746514063319999252609551229322067975253165160806203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525 给药提取物的制备与测定 5.1金丝桃苷纯品给药溶液的制备精密称取40.0mg金丝桃苷于20mL容量瓶中，加入20%丙二醇超声助溶，加生理盐水配成2mg/mL的金丝桃苷注射液供大鼠腹腔给药，按照0.5mL/100g给药，相当于根据大鼠体重10mg/kg给药。5.2 菟丝子、五子衍宗方样品处理方式 五子衍宗方中五味药材均为种子类药材，其中含有大量的油脂、多糖及各种色素等，首先考察了60，80，95乙醇的提取物，其中60乙醇提取物中含有大量多糖，及部分油脂。提取烘干过程中呈粘稠状，无法做成制剂形式。部分提取物干粉采用纯品金丝桃苷制剂形式形成混悬物，无法给药。曾尝试采用大孔树脂进行