农药的代谢医学宣教培训课件.ppt
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1、农药的代谢医学宣教,农药的代谢医学宣教,代谢研究方法,活体研究in vivo离体研究 in vitro,2,农药的代谢医学宣教,代谢研究方法活体研究in vivo2农药的代谢医学宣教,组织匀浆,沉淀(细胞核、组织碎片)滤液,上清液 沉淀(叶绿体),上清液 沉淀(线粒体),上清液(胞液、核糖体)沉淀(微粒体),100,000105,000g,1hr,9,00011,000g,30min,1,0003,000g,10min,过滤,3,农药的代谢医学宣教,组织匀浆沉淀(细胞核、组织碎片)滤液,代谢酶,初级代谢酶水解酶、多功能氧化酶(MFO)次级代谢酶谷光甘肽-s-转移酶(GST)、葡萄糖醛酸转移酶(
2、glucuronyl transferase)、硫酸转移酶(sulphate esterase)、甘氨酸转移酶、葡萄糖转移酶,4,农药的代谢医学宣教,代谢酶 初级代谢酶4农药的代谢医学宣教,多功能氧化酶(MFO),RH O2 2H ROH H2O,MFO是膜结合酶。主要由P450、NADPH-细胞色素还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、磷脂等成份构成。其中细胞色素P450的还原形式与CO结合后在450 nm附近产生特征吸收峰,故命名为P450。细胞色素P450几乎在所有的生物中都存在,包括动物、植物、昆虫、细菌等。,5,农药的代谢医学宣教,多功能氧化酶(MFO)RH O2 2H,反应机理,P
3、450本质上属于血红素硫铁蛋白(heme-thiolate protein),上面有底物和氧的结合位点。NADPH-细胞色素还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶在酶系中起电子传递作用。,6,农药的代谢医学宣教,反应机理P450本质上属于血红素硫铁蛋白(heme-thi,7,农药的代谢医学宣教,7农药的代谢医学宣教,This entire reaction cycle usually takes between 1 and 10 seconds,8,农药的代谢医学宣教,This entire reaction cycle usu,P450的多样性,根据分类命名系统,P450蛋白或基因全序列同源部
4、分40%为同一家族(family),用一阿拉伯数字表示;同源性40%65%为同一亚族(subfamily)界限,在家族表达式后加一大写英文字母;每一亚族内的单个酶则在表达式后再加一阿拉伯数字,9,农药的代谢医学宣教,P450的多样性 根据分类命名系统,P450蛋白或基因全序,哺乳动物,目前已知哺乳动物体内有14 个CYP450 家族,即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51(夏伟,2000)。其中CYP1 CYP4 家族是代谢外来化合物的主要酶系,并且各同工酶有其较固定的代谢底物、反应类型。CYP1A 的底物以环境致癌物为主,如多环芳烃、黄曲霉毒素。CYP2E1
5、则主要参与乙醇等小分子化合物的代谢,特别是亚硝胺在体内产生致癌、诱变产物必须经CYP2E1 的A2羟化作用。大多数临床口服药物在体内的代谢酶是CYP3A。,10,农药的代谢医学宣教,哺乳动物目前已知哺乳动物体内有14 个CYP450 家族,植物,植物的第一个P450cDNA 是CYP71A1,它是由Bozak等(1990)由鳄梨中分离出的与成熟有关的P450基因。至今已鉴定了90多个植物P450 基因。它们分属于27 个家族(CYP51,CYP71,CYP72 CYP96)(刘宛等,2001),11,农药的代谢医学宣教,植物植物的第一个P450cDNA 是CYP71A1,它是由,昆虫,昆虫的第
6、一个P450cDNA是Snyder和Davidson(1983)从果蝇Drosophila mdanogaster中分离的,但当时并不知道它是细胞色素P450基因,后来被重新发现而被定名为CYP4E1。昆虫的P450基因总数尚不清楚,至今已鉴定的昆虫P450基因已超过50个,分属6个基因家族(CYP4,CYP6,CYP9,CYP12,CYP28,CYP18)。其中CYP4,CYP6,CYP9,CYPI2,CYP28等5个基因家族为昆虫所特有(潘贻武等,2007)。,12,农药的代谢医学宣教,昆虫昆虫的第一个P450cDNA是Snyder和Davids,P450的可诱导性,P450可以代谢许多亲
7、脂化合物,包括胆固醇、类固醇、激素、维生素D等内源化合物和外源非极性化合物。天然化合物 除虫菊素pyrethrins、单萜类monoterpene、黄酮类flavonoid、香豆素coumarins、甾醇、异黄脑素、2十三烷酮、2十三烷酮、吲哚3甲醇、尼古丁、胡萝卜素、己醇、保幼激素、蜕皮酮、等等。人工化合物苯巴比妥phenobarbital(BP)、3甲基胆蒽(3MC)、DDT、环戊二烯类杀虫剂、萘napthaiene、西维因、有机磷化合物(TOCP、TPP、DEF)、丁羟基丁氧化物butylhydroxy butoxide、丁羟基甲苯butylhydroxy toluene、烷基苯alky
8、lbenzenes、polychlorinated bephenyls(PCBs)、增效醚piperonyl butoxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenylureas、保幼激素类似物、等等(邱星辉、冷欣夫,1997),13,农药的代谢医学宣教,P450的可诱导性P450可以代谢许多亲脂化合物,包括胆固醇,14,农药的代谢医学宣教,14农药的代谢医学宣教,根据现有资料,细胞色素P450能够被大约200种化合物诱导,能够催化约40种类型的化学反应,现有底物约1,000种(邱星辉、冷欣夫,1997)。,15,农药的代谢医学宣教,根据现有资料,细胞色素P450能够被大约200种化合物诱
9、导,,MFO参与的代谢反应,烷基羟化,芳基羟化,16,农药的代谢医学宣教,MFO参与的代谢反应 烷基羟化芳基羟化16农药的代谢医学宣教,O烷基羟基化,N烷基羟基化,17,农药的代谢医学宣教,O烷基羟基化N烷基羟基化17农药的代谢医学宣教,环氧化,脱S(活化),18,农药的代谢医学宣教,环氧化脱S(活化)18农药的代谢医学宣教,S加氧(活化),19,农药的代谢医学宣教,S加氧(活化)19农药的代谢医学宣教,MFO与抗药性的关系,家蝇CYP6A1能够将艾氏剂和氯丹分别氧化为狄氏剂和环氧化氯丹。重组杆状病毒感染的鳞翅目细胞系统中表达的CYP6A2除了能够将艾氏剂和氯丹氧化相应的环氧化物,还能通过脱硫
10、作用和氧化酯解作用分别将有机磷杀虫剂二嗪磷diazinon代谢为diazoxon和2异丙基4甲基6羟基嘧啶。果蝇CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表达 CYP6D1mRNA的高效表达与家蝇对二氯苯醚菊酯的抗性有关(朱礼华等,2000),20,农药的代谢医学宣教,MFO与抗药性的关系 家蝇CYP6A1能够将艾氏剂和氯丹分别,CYP4mRNA的高效表达与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性有关(朱昌亮等,2001),21,农药的代谢医学宣教,CYP4mRNA的高效表达与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性有关(,MFO的检测,P450含量测定 底物氧化法mRNA含量测定,22,农药的代谢医学宣教,MFO的检测 P45
11、0含量测定 22农药的代谢医学宣教,P450含量测定,特征光谱:还原性P450与CO结合后在450nm处有最大吸收峰在加有适量连二亚硫酸钠的试管里,加入微粒体悬液,混匀,通CO气体1min,在分光光度计上400500 nm 范围进行扫描。计算公式为P450=(A450一A490)(91Pr)1 000(nmolmg蛋白),其中91为吸光系数,Pr为蛋白质浓度(mgmL)(严敏芬等,2006),23,农药的代谢医学宣教,P450含量测定特征光谱:还原性P450与CO结合后在450,底物氧化法,7-乙氧基异吩恶唑 7-乙氧基异吩恶唑0-脱乙基酶(EROD)7-乙氧基豆香素 7-乙氧基豆香素0-脱乙
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