分子生物学基因工程与基因体外表达课件.ppt

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1、全国高等医药教材建设研究会卫生部规划教材全国高等学校教材 供七、八年制临床医学等专业用医学分子生物学Medical Molecular Biology主编 冯作化人民卫生出版社 2005年8月第一版课件制作：吴耀生(版权所有)广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 2008.10,全国高等医药教材建设研究会,第十三章,基因工程与基因体外表达,Gene Engineering and Gene Expression,第十三章基因工程与基因体外表达Gene Engineerin,目的与意义,1.获得感兴趣的目的基因,2.研究基因结构特征,3.表达基因产物,4.研究基因功能,目的与意义1.

2、获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征3.表,基本要素,1. 目的基因 (target genes),2. 工具酶 (tool enzymes),3. 载体 (vectors),4. 宿主细胞 (host cells),基本要素1. 目的基因 (target genes)2. 工,Main contents,工具酶,DNA载体,基因克隆过程,真核细胞基因转染,基因改造,克隆基因表达,电子克隆,基本概念及背景,Main contents 工具酶DNA载体基因克隆过程真,For Example,如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?,1. 查资料认识FPS,2. 设计实验方案,3. 可行性

3、分析,For Example 如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(,For Example,For Example,FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RACE,改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNA,RT-PCR扩增fps部分保守序列,3-RACE 及克隆测序,5-RACE 及克隆测序,序列拼接,FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RA,mRNA: 5 AAAAAA3,TTTTTTT-接头,cDNA:,Oligo dT接头,基因特异性引物,3 Full RACE原理图,mRNA: 5,5 Full RACE原理图,(1),5-端磷酸化RT-Primer,逆转

4、录,RNA分解,1st PCR primers,2nd PCR primers,用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物,未知区域,1stand 2nd PCR,5-端磷酸化RT primer部位,包含未知的5上游区域的扩增产物,(2),(3),(4),5 Full RACE原理图(1) P5-端磷酸化RT-,Thank You,Thank You,DNA重组 DNA recombination,Some concerned concepts:,DNA重组技术 DNA recombination technique,分子克隆 Molecular cloning,基因工程 Genetic

5、engineering,克隆 Cloning,DNA重组 DNA recombinationSom,分子生物学-基因工程与基因体外表达课件,三大理论基础,1953年，Watson 和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。,40年代，O.T. Avery等通过肺炎链球菌转化实验发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质,50年代末到60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。,三大理论基础1953年，Watson 和Crick揭示了DN,三大技术发明,DNA分子的体外切割与连接技术 19

6、70年 Smith, Wilcox 流感嗜血杆菌(Haemopbilus influenzae) Hind II 1972年 Boyer EcoR I “GAATTC” 1967年 世界上5个实验室几乎同时发现了DNA ligase 1970年 T4 DNA ligase,大肠杆菌转化体系的建立-复制工厂,基因工程载体的使用：plasmid, phage, viruses,三大技术发明 DNA分子的体外切割与连接技术大肠杆菌转化体系,1978年Nobel 医学与生理学奖,The Nobel Prize in Medicine was awarded, in 1978, to Daniel Na

7、thans, Werner Arber, and Hamilton Smith for the discovery of restriction endonucleases. Their discovery lead to the development of recombinant DNA technology that allowed, for example, the large scale production of human insulin for diabetics using E. coli bacteria. Over 3000 restriction enzymes hav

8、e been studied in detail, and more than 600 of these are available commercially and are routinely used for DNA modification and manipulation in laboratories.,1978年Nobel 医学与生理学奖The Nobel Pr,分子生物学-基因工程与基因体外表达课件,DNA ligase repairing chromosomal damage.ligase I, DNA, ATP-dependent,DNA ligase repairing c

9、hromosom,第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作,工具酶(Tool enzymes )-,用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进行应用,一、 限制酶 (RE , restriction endonuclease ),二、其他工具酶 (other tool enzymes),第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作工具酶(Tool en,一、RE在基因克隆中用于切割DNA,RE (restriction enzyme, restriction endonuclease )-限制性核酸内切酶，限制酶，能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定

10、末端的酶,一、RE在基因克隆中用于切割DNARE (restricti,Restriction enzyme Functions:能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键(1) Sorting of restriction enzyme有三型，但最重要的是II型酶(2) Naming of RE,细菌属名,细菌种名,细菌菌株,编号,Escherichia coli RY13 I,属Genus, 种-species, 菌株-strain,EcoR I,Restriction enzyme Functions:细,Two catalytic manganese ions (one from ea

11、ch monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).,Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes) based on the PDB 1QPS

12、 X-ray crystallographic coordinates.,Two catalytic manganese ions (,(3) 限制酶的识别和切割位点Characters: 通常识别46个碱基，少数识别8个所识别的序列一般为回文结构(palindrome)在特异位点内切割DNA双链，产生两种末端,粘性末端,平端,5-粘性末端,3-粘性末端,5-CCCGGG-33-GGGCCC5,5-CCC GGG-33-GGG CCC-5,+,平端切割(blunt end, such as Sma I ),Go to 109,(3) 限制酶的识别和切割位点粘性末端平端5-粘性末端3,5-GGT

13、GAATTCAGC-33-CCACTTAAGTCG5,5-TTGCTGCAGAAG-33-AACGACGTCTTC5,5-粘性末端 (EcoR I ),3-粘性末端 ( Pst I ),5-GGTG AATTCAGC-33-CCACTTAA GTCG5,+,5-TTGCTGCA GAAG-33-AACG ACGTCTTC5,+,5-GGTGAATTCAGC-35-TTGCTGCA,(4) 同工异源酶( isoschizomers ) 来源不同，但能识别和切割同一位点的RE 例：Bam H I 不需ATPRE识别序列长度与切点数：对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之,(4)

14、 同工异源酶( isoschizomers ),二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶,其他工具酶-用于对DNA分子进行多种操作，也叫修饰酶,作用：剪切、补平、连接、化学修饰等,二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶其他工具酶-用于对,常用：(1) DNA polymerase I，Klenow Fragment (2) Reverse transcriptase(3) T4 DNA ligase(4) Alkaline phosphatase(5) Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT(6) Taq DNA polymeraseSo on,常用：,

15、(1) DNA polymerase IActivities：53聚合活性， 53及 35外切活性Functions：在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体外，缺口平移制备探针,DNA polymerase I,Klenow fragment (76KD),Another small fragment,枯草杆菌蛋白酶,(1) DNA polymerase IDNA polym,Klenow片段,E.coli DNA pol I,53外切酶,53聚合酶,35外切酶,用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶,53聚合酶,35外切酶,Klenow fragment 用途：,1) 补齐双链DNA的3-末端

16、2) 通过补齐3端使3端标记3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成4) DNA序列分析,Klenow片段35kD76kDNCE.coli DNA,常用的reverse transcriptase:,禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶,(2) Reverse transcriptase,用途：合成cDNA，构建cDNA文库,Moloney 小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶,常用的reverse transcriptase:禽类成骨细,第二节 基因克隆需要特定的DNA载体,基因克隆为什么需要载体？,载体的类型-克隆载体，表达载体,载体的来源,细菌质粒,噬菌体DNA(DNA, M13 DN

17、A),病毒DNA,人工载体(cosmid)等,第二节 基因克隆需要特定的DNA载体基因克隆为什么需要载体,DNA载体(vector)-能与DNA片段连接，构建成新的重组DNA分子，并可携带该外源DNA片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选,载体的概念,DNA载体(vector)-能与DNA片段连接，构建成,Cloning vector能够携带感兴趣的外源DNA（target DNA）进入宿主细胞，并将外源DNA在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些DNA分子称为Cloning vector 。,Cloning vector classes,Plasmid DNA (质粒

18、DNA)Phage DNA (噬菌体DNA)Virus DNA (病毒DNA),Expression vector 能使外源基因在宿主中表达的载体,Cloning vector能够携带感兴趣的外源DNA,Expression vector: 含表达调控有关的元件,When E coli is used as host cell, plasmid, phage, cosmid, M13 phage can usually be used as vectors,载体的本质是什么？,Vector characters (cloning vector):能在宿主细胞中自我复制、自我表达分子相对较小，在

19、宿主细胞中有高拷贝具有遗传标志有多个限制性酶单一酶切位点(多克隆位点)易与宿主DNA相分离,Expression vector: 含表达调控有关的元件W,一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒,(一)质粒是常用的克隆载体,Examples:pBR322pUC,Characters:Small molecular weight, high copiesMore than one genetic markMultiple cloning sites, MCS,一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒(一)质粒是常用的克隆载体,pBR322,Turn to 64,pBR322Turn to 64,pUC19,

20、pUC19,(二) 噬菌体经过重组也可以携带外源 DNA,Examples: bacteriophage, phage; M13 phageIt is a kind of virus which can infect bacteria, bacteriophages in common use:EMBL spectrum gt spectrumCharon spectrum,(二) 噬菌体经过重组也可以携带外源 DNAExamples, bacteriophage, phage 噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环状DNA分子；分离产物为双链线状DNA分子，有天然的粘性末端（称COS位点），进

21、入宿主菌后可自行环合。基因组DNA长约为48.5Kb,共有66个基因，较复杂。,Character：1、其生长必需的序列位于左右二臂上，中部约30%为生长非必需；2、成熟需要包装（大小为原来的75-105%时）,Two kinds of vectors：置换型载体；插入型载体, bacteriophage, phageCharacte,置换型噬菌体载体：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂结合。替代片段可达923Kb。,左臂,中央片段,右臂,酶切点,酶切点,切除后用目的基因取代,COS位点,COS位点（12bp),置换型噬菌体载体：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目

22、的,The life period of phage(噬菌体的生活周期):,Lysogenic pathway( 溶原生长途径),Lysis pathway(溶菌生长途径),The life period of phage(噬菌体,溶原生长,溶菌生长,溶原转溶菌生长,以噬菌体为媒介的转导作用,溶原生长溶菌生长溶原转溶菌生长以噬菌体为媒介的转导作用, gt10:insertion vector; multiple cloning site: CI,The positive marks of screening:Whether the recombinant vector can be wrapp

23、ed(If no extraneous DNA replaced, the vector would be too small to be wrapped),With insertion, CI activity lost, to be transparent spots; Without insertion, CI keeps intact, to be turbid spots, gt11：insertion vector; MCS: lac Z；expressed,With insertion into lac z of gt11, white spotsOtherwise blue s

24、pots, gt10:insertion vector; multi,(四) 粘性质粒适合克隆较大的DNA片段,粘性质粒(cosmid)由DNA的cos区与质粒重新构建的载体，具有与质粒相同的结构特点，为双链环状DNA。It is constructed with the cos region of DNA and plasmid, which is double cycle DNA with bigger content for cloning (4050kb),(四) 粘性质粒适合克隆较大的DNA片段粘性质粒(cosmi,Characters:1) With antibiotics mar

25、ks and replication element itself2) With cos region of phage, can be wrapped3) With one or more cloning sites4) Small molecular weight5) non-recombination cosmid too small to be wrapped, so it is screened easily,Characters:,(三) M13噬菌体适合制备单链DNA,M13 bacteriophage:,It is a kind of E coli phage, the gen

26、ome6.5kb, a cycle DNA containing singlestrand DNA,Two forms:,Wild form; Replication form (RF),The most merit:,Can be released from host as single strand,(三) M13噬菌体适合制备单链DNAM13 bacteri,M13 phage Characters:,In vivo, double strands DNA (can be replicated),In vitro, single strand DNA (can be used as te

27、mplate for DNA sequencing, or make DNA probes for hybridization ),After entering host cells, it is replicated to double strands DNA and becomes replicational form DNA ( RF DNA ) which can be used as cloning vector,M13 phage Characters:In vivo,(五) 病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞,Virus vectors in common use:,逆转录病

28、毒，腺病毒，腺相关病毒，EB病毒等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞,Characters:,多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记及pBR322复制起始点组成,Other vectors:,YAC, yeast artificial chromosome (0.52Mb),BAC, bacterial artificial chromosome (0.4Mb),(五) 病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞Virus v,二、表达载体将外源基因带入宿主并表达,Expression vectors Concept:,The conditions for expression v

29、ector:With expression structures except for the characters of cloning vectors,The vectors which can make the extraneous DNA be expressed in host cells are termed as expression vectors.,二、表达载体将外源基因带入宿主并表达Expression v,Sorts:,Expression vectors of E coli (prokaryote ),Expression vectors of eukaryote,Ex

30、pression vectors of mammal animals,Sorts:Expression vectors of E,(一) 原核表达载体适于原核细胞表达外源基因,Expression vectors of E coli:,除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体结合位点，转录终止序列等表达元件,(一) 原核表达载体适于原核细胞表达外源基因Expressi,Trp-lac promoter ( or tac promoter)Inducer: IPTGStrains: RB791, XL-1-blue, SB221, JM 109,1. Promoter,T7 of T7 phage

31、 It is a high effective expression promoterStrain: JM109(DE3),PL of -phage (temperature induce promoter ) Controlled by cIts857 (sensitive to temperature), clts857为温度敏感阻抑物Strain: M5219,Trp-lac promoter ( or tac prom,原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制,A,U,U C C U,C,CACUAGG,核蛋白体小亚基的16S-rRNA,5,A G G A PuPuUUUPuPu

32、AUG,3,mRNA,Rps辨认序列,SD序列,Ribosome-binding site, RBS Including AUG, SD sequence,2. 核糖体结合位点(RBS),原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制AUU C,作用：,3. 转录终止序列,保证外源基因在宿主中的高效表达,使读码框架能够正确转录,作用： 3. 转录终止序列保证外源基因在宿主中的高效表达使读,(二) 真核表达载体适于真核细胞表达外源基因,Eukaryote expression vectors:,含有一定的原核序列：E coli中的ori位点；antibacterial site,含有一定的真核序

33、列：真核细胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核复制起点，启动子/ 增强子，克隆位点，加尾信号等,(二) 真核表达载体适于真核细胞表达外源基因Eukaryot,Expression vectors of mammal animalIf a gene needs to be expressed in mammal animal cells, the eukaryote expression vector must be used.,The essential elements including:Replica origin, antibiotics sites, eukaryote prom

34、oter, enhancer, cloning sites, termination signal, poly A signal,Expression vectors of mammal,第三节 基因克隆过程包括五个基本部分,Gene cloning process,(1) 制备目的基因及相关载体,(2) 将目的基因与载体进行连接,(3) 将重组DNA导入受体细胞,(4) DNA重组体的筛选与鉴定,(5) DNA重组体扩增、表达及其他研究,分,切,接,筛,转,第三节 基因克隆过程包括五个基本部分Gene clonin,一、采用不同方法获取目的基因,Methods to get a target

35、 gene:,(1) To prepare genomic library(2) To prepare cDNA library or cDNA(3) To PCR(4) To synthesize the DNA fragment by chemical method,一、采用不同方法获取目的基因Methods to get a,(一) 从基因组文库中获得目的基因,Genomic library :,指含有一个机体基因组DNA的全套重组DNA分子的克隆群体,用于构建基因组文库的载体：,-噬菌体(- phage)，粘性质粒(cosmid),(一) 从基因组文库中获得目的基因Genomic li

36、bra,Genomic library construction:,分离高分子量DNA,分离回收1525 kb的DNA片段,部分消化，以切成一定大小片段,回收片段与适当载体连接,所有重组DNA分子转入宿主细胞并扩增,基因组文库,Genomic library construction:分,随机文库克隆数目计算,随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库，有：,N: 克隆数目,P: 设定的概率值(如：0.99),x: 插入片段平均大小(1520kb),y: 植物基因组大小(以kb计),如果插入片段平均大小为20kb，某植物基因组大小为4x108bp，P=0.99时，根据上式，N1

37、X105。含1X105个克隆的基因文库相当覆盖了5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。,随机文库克隆数目计算随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数,植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数,植物种类 基因组大小(bp)a 重组噬菌斑数b,拟南芥 7.7X107 2.1X104,大豆 8.7X108 2.4X105,菜豆 1.8X109 4.9X105,碧东茄 1.9X109 5.1X105,烟草 3.8X109 1.0X106,玉米 3.9X109 1.1X106,小麦 1.5X1010 4.1X106,a，基因组大小引自Rogers和Bendich; b.

38、假设插入片段为17kb,概率为0.99。,植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数植物种类,(二) 从cDNA文库中获得目的基因,cDNA library :,指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达基因的全部cDNA 克隆的群体,cDNA library characters:,不含内含子，用mRNA经逆转录构建,cDNA library vectors:,-gt10; -gt11; Ziplox et al,(二) 从cDNA文库中获得目的基因cDNA library,cDNA library construction:,分离mRNA,RNase H水解去掉mRNA,以oligo(dT)为

39、引物，合成cDNA第一链,随机引物，DNA pol I合成第二链,修齐两端，加人工接头，,与载体连接，得到cDNA重组体，,所有cDNA 重组体均转入宿主扩增,cDNA 文库,cDNA library construction:分离mR,(三) 利用PCR技术获得目的基因,采用T载体(AT克隆)：,pGEM-T vector; pMD18-T Vector,合成长度有限,可人工设计相应的序列，不必使用天然模板,(四) 人工合成目的基因,(三) 利用PCR技术获得目的基因采用T载体(AT克隆)：p,分子生物学-基因工程与基因体外表达课件,Plasmid phage cosmid M13 phag

40、e,Capacity 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb of cloninggDNA library - + + -cDNA library + + - -Subcloning + - - +Sequencing + + - +E coli expression + + - -,二、依据基因克隆的目的选择和准备载体,Cloning vectors in common use:,Plasmid phage co,(1) The ligation by cohesive endsAdvantage: easily linked Disadvantage: easily to be

41、cycled self bidirection insertion(2) The ligation with artificial linker (3) The ligation with homopolymeric tail (4) The ligation by blunt ends High ATP con. T4 DNA ligase should be used,三、选择适当的策略将DNA片段进行连接,Methods in common use:,(1) The ligation by cohesive e,(一) 粘性末端的连接,全同源粘性末端 最方便，但载体自身环化，并为双向插入

42、,例：用EcoR I分别切割载体和目的DNA：,切割载体：,切割目的DNA：,(一) 粘性末端的连接全同源粘性末端 最方便，但载体自,双向插入示意图：,GCTTAAAATTCGA,粘性末端的连接,粘性末端的连接,(二) 用人工接头法克隆cDNA,连接酶,碱性磷酸酶,(二) 用人工接头法克隆cDNA连接酶碱性磷酸酶,(三) 同聚物接尾法克隆双链DNA,转化适当的宿主,退火,载体,(三) 同聚物接尾法克隆双链DNA转化适当的宿主退火载体,(一) 转化(transformation ),四、重组DNA需要导入宿主细胞进行扩增,Methods in common use:,(二) 感染(infecti

43、on ),(三) 转染(transfection ),(四) 电穿孔(electroporation),(一) 转化(transformation ) 四、重组DN,(一) 转化是直接将DNA导入细菌的方法,Transformation：,指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。,宿主菌：E coli,感受态细胞的制备：低温CaCl2处理，使细胞通透性增加，易于摄取外源DNA，这种细胞称为感受态细胞(competent cell),(一) 转化是直接将DNA导入细菌的方法Transforma,(二) 感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主,Infection：,

44、指噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿主细胞的过程,(二) 感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主Infectio,用于包装的宿主菌：,琥珀突变株Dam溶菌物：含头部蛋白,突变株Eam溶菌物：含尾部蛋白,Dam溶菌物 + Eam溶菌物 + DNA重组体,包装噬菌体,重组有外源DNA的逆转录病毒载体,感染,辅助病毒-2细胞,包装成病毒颗粒有感染能力,用于包装的宿主菌：琥珀突变株Dam溶菌物：含头部蛋白突变,(三) 转染是将外源DNA导入真核细胞的方法,Transfection：,指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片

45、段而获得新的表型的过程,Methods：,电穿孔,磷酸钙共沉淀法,脂质体融合法,进入细胞的DNA存在方式,染色体外,整合至宿主基因组中,(三) 转染是将外源DNA导入真核细胞的方法Transfec,(一) 遗传学方法,五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定,Methods in common use:,(二) 免疫学方法 -检测表达产物,(三) 核酸杂交,(四) PCR技术,抗性标记,表型标记,插入失活,互补,(五) 酶切鉴定,Go to 23,Go to 103,Go to 104,Go to 105,(一) 遗传学方法五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定Meth,第四节 真核细胞基因转染,Tra

46、nsfection：,指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程,一、真核细胞转染的方法与基本原理,二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选,第四节 真核细胞基因转染Transfection：指真核细,(一) 磷酸钙共沉淀示介导基因转染,一、真核细胞转染的方法与基本原理,Methods in common use:,(二) 电穿孔法介导基因转染 (electroporation),(三) DEAE-葡聚糖法介导基因转染 (DEAE-dextran),(四) 脂质体介导基因转染 (liposome ),(五) 显微注射法( microinjection ),Calcium phos

47、phate co-precipitation (1%),(一) 磷酸钙共沉淀示介导基因转染一、真核细胞转染的方法与基,Electroporation(电穿孔法),Extraneous DNA,Host cells,Electricity with high frequency,Electroporation(电穿孔法)Extraneo,(一) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选,二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选,Methods in common use:,(二) 药物筛选转染细胞,稳定转染细胞株的筛选,(一) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选 二、转染细胞可,(一) 利用TK-细胞突

48、变株进行转染细胞筛选,Principle：,TK (thymidine kinase) 是催化核苷酸补救合成的关键酶,氨基喋呤(aminopterin, A )是从头合成途径的抑制剂，A的加入使细胞主要依赖于补救合成,TK-选择系统,Host -TK - 细胞株(TK表达缺陷),培养基 -HAT培养基,H, hypoxanthine; A, aminopterin; T, thymine,(一) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选 Princip,Tk -,氨基蝶呤（A）处理,抑制二氢叶酸还原酶,四氢叶酸逐渐耗尽,dUMP,dATPdCTP,(-),(+),H,dATPdCTP,T,dTTP

49、,Tk +,培养基含H、T,A,细胞不能存活,细胞能够存活,补救合成,tk基因导入tk - 细胞,细胞能够存活,在含HAT培养基中,tk选择系统原理图解,(越过A的抑制),Tk -氨基蝶呤（A）处理抑制二氢叶四氢叶酸dUMPdATP,The screening with antibiotics, G418 (geneticin, 新霉素衍生物),(二) 药物筛选转染细胞,The most used antibiotic marker: neor,The screening with antibiotics,新霉素抗性选择系统,新霉素,干扰原核生物蛋白合成,不影响真核生物蛋白合成,新霉素类似物G

50、418,干扰原核生物蛋白合成,干扰真核生物蛋白合成,细菌新霉素抗性基因neor,表达氨基糖苷磷酸转移酶(APH),使G418失活,表达neor 的细胞可在含G418的培养基中存活,新霉素抗性选择系统新霉素干扰原核生物蛋白合成不影响真核生物蛋,第五节 利用重组DNA技术进行基因改造,Methods in common use:,定点诱变技术,寡核苷酸介导定点诱变技术,PCR介导定点诱变技术,目的,改变基因的一级序列特征,第五节 利用重组DNA技术进行基因改造Methods in,一、对特定基因可进行定点诱变,What is the site-directed mutagenesis (目的基因的