放射免疫分析课件.ppt
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1、放射免疫分析 Radio immunoassay (RIA),王海龙2006.03,1,放射免疫分析 Radio immunoassay (RI,探讨的主要内容,基本概念 基本原理 放射免疫方法的建立 放射免疫分析的要求和影响因素 免疫放射的基本概念 放免分析的应用,2,探讨的主要内容 基本概念2,第一节 放射免疫概述,3,第一节 放射免疫概述3,一、概念 一种体外超微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素(如125I)示踪技术与高度特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。,特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。,4,一、概念 特别适用于微量蛋白质
2、、激素和多肽的定量测定。4,二、基本原理1、标记抗原(Ag*) 、非标记抗原(Ag)和特异性抗体(Ab)三者同时存在于一个反应体系,标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力,两者相互竞争结合特异性抗体。 Ag* + Ab = Ag* Ab + Ag AgAb,=,5,二、基本原理=5,2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的,非标记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗体发生竞争性结合。反应达到平衡时,标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。 非标记抗原量增加,相应地结合较多的抗体,从而抑制标记抗原对抗体的结合,使标记抗原抗体复合物相应减少,游离的标记抗原相应增加,
3、亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。,6,2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的,非标记抗原是变化的,3、将Ag* Ab与游离Ag*分开,分别测定其放射性强度,就可算出结合态的Ag* (B)与游离态的Ag* (F)的比值(B/F),或算出其结合率B/(BF),这与标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应,计算相应的B/F,可以绘制出一条剂量反应曲线。4、受检标本在同样条件下进行测定,计算B/F值,即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。,7,3、将Ag* Ab与游离Ag*分开,分别测定其放射性强度,就,剂量反应曲线,8,剂量反应曲线 8,放射免
4、疫分析原理示意图,9,放射免疫分析原理示意图 9,三、放射免疫测定的优点1)灵敏度高 大分子,ng/ml水平;小分子,pg/ml水 平。2)特异性好3)精确地定量4)操作方法越来越简便5)抗体的来源日益广泛,放射免疫可测定的微量物 质越来越多。,10,三、放射免疫测定的优点10,第二节 放射免疫基本试剂,11,第二节 放射免疫基本试剂11,一、标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据,由于以标准品的量用来表示被测物质的量,标准抗原的基本要求:(1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致,即它们与 抗体的亲和力和特异性应相同。 (2)抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好
5、的稳定性。,12,12,二、标记物1、标记抗原应具备:比放射性高,以保证方法的灵敏度;免疫活性好;所用的核素的半衰期尽可能长,标记一次可较 长时间使用,这对来之不易的抗原尤其重要;标记简便、易防护。,13,二、标记物13,2、标记用的核素有放射射线和射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr和60Co;后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。125I是目前常用的RIA标记物。标记125I的方法可分两大类,即直接标记法和间接标记法。,14,2、标记用的核素有放射射线和射线两大类。前者主要,三、抗体(抗血清) 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、
6、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体,选取特异性高、亲和力强及滴度高的血清,为RIA所用。,15,三、抗体(抗血清)15,四、B与F分离剂 以2%加膜活性炭溶液为例,2%加膜活性炭溶液的配制:活性炭2g(杭州木材厂生产,森工牌732型)右旋糖酐T200.2g加0.1mol/L PBS 至100ml电磁搅拌1h,然后置于普通冰箱待用。,16,四、B与F分离剂16,五、缓冲液 目前最常用的缓冲液有下列几种:磷酸盐缓冲液;醋酸盐缓冲液;Tris HCl缓冲液;硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。保护蛋白防腐剂酶抑制剂阻断剂载体蛋白,17,五、缓冲液17,六、试剂盒要注意的问题1)检查药盒的数量与
7、药盒说明书是否一致(一般药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂)。2)标准品,抗血清、标记抗原要在-20以下保存, 加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀,标记抗原最好当天溶解,当天使用。3)分离剂不能冷冻保存应保存在4冰箱内。4)缓冲液,每种药盒的缓冲液不相同,不能相互使用。,18,六、试剂盒要注意的问题18,第三节 放射免疫测定,19,第三节 放射免疫测定19,一、样品的处理 血清、血浆(抗凝),尿液,组织匀浆 用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。 血清或血浆抽入试管-20保存3个月, -70保存6个月。,20,一、样品的处理20,二、测定方法用放射免疫分析进行测定时分三个步骤,即抗原抗体的
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