土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究.docx
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1、FUYANGTEACHERSCOLLEGE本科毕业论文(设计)题目:土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究学生:蒋泽琦学号:201040320111学院:生命科学学院专业:生物科学入学时间:2010年09月15日指导教师:张秋研职称:助理实验师完成日期:2014年05月04日诚信承诺我谨在此承诺:本人所写的毕业论文土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究均系本人独立完成,没有抄袭行为,凡涉及其他作者的观点和材料,均作了注释,若有不实,后果由本人承担。承诺人(签名):土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究不同因素对酪氨酸酶活性的影响学位申请人:蒋泽琦导师:张秋研摘要酪氨酸酶从目前的研究看来是一种由
2、Cu或C;作为辅助因子构成的全酶,空气中的氧对多巴的氧化反应就是由其催化的。而我们可以通过多巴转换反应过程中的颜色变化检测其中的催化过程,所以酶的活性我们可以通过对于吸光度随时间的变化的测定来求得。本论文则是首先从土豆中提取出酪氨酸酸,而后采用分光光度计法对其的活性进行测定,大约于48Onm处使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光度,将吸光度对于时间的变化率(AV)作为反应的速率,并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线,得出酪氨酸的活性。关键词酪氨酸酶;提取;活性;活性动力学曲线ExtractionandcatalyticactivityofTyrosinasepotatoesAbstract
3、:FromtyrosinaseappearstobeacurrentstudyofCu+orCu2+asacofactorholoenzymecomposedoftheoxygenintheairisoxidationofdopabycatalysis.Wecanconvertthecatalyticprocessandreactionprocesswhereinthecolorchangeisdetectedbydopa,theenzymeactivitythatwecanchangewithtimeforthemeasurementofabsorbancetoobtain.Thispape
4、risthefirstextractfrompotatotyrosinase,followedbythespectrophotometeritsactivitywasmeasuredatapproximatelyat480nmusingaUVspectrophotometerabsorbancepotatoextract,theabsorbancechangeswithrespecttotimerate(A/V)asthereactionrate,andthuscreateasolutionfortheconversionofdopakineticcurvederivedtyrosinasea
5、ctivity.Keywords:Tyrosinase;extraction;activity;activitykinetics1引言12材料与方法32.1材料32.2方法31. 2.1酪氨酸酶的提取32. 2.2酪氨酸最大吸收波长确定33. 2.3酪氨酸酶的活性测定32.2.4酶活性因素测量33结果与分析44. 1酪氨酸最大吸收波长确定43.2建立酶的动力学曲线43.3计算酶的活性63.4影响酶的活性的因素研究71.1.1 4.1PH值对酶活性的影响71.1.2 温度对酶活性的影响71.1.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响84结论95参考文献101引言酪氨酸酶(Tyrosinase),简称T
6、YR,是一种75kD含铜的多酚氧化酶,酪氨酸酶非常普遍的存在于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶在黑色素合成的的过程中是最为关键的酶,是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶,同时也是目前已知的唯一的的黑色素代谢酶,是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶。酪氨酸酶具有很多的特征性的催化活性,它既可以当做酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶,又可以当做5,6-二羟基咧味氧化酶,在黑色素生成过程中起着非常重要的作用。对于人体研究来说,它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关。因此对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控,以及酪氨酸酶的抑制剂和激活剂的研究,引起国内外的广泛重视。目前,对酪氨酸酶活性中心及其催化功能的研究
7、比较透彻,但对酪氨酸酶蛋白的立体结构尚不清楚。很多复杂的的有机物合成反应或者分解反应需要在高温、高强酸碱或者减压等很严苛的特定条件下才能进行,而在生物体内,即使在十分温和的条件下,如常温、常压和近中性溶液中,许多复杂的化学反应却能顺利进行,其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是我们可以看做一种生物催化剂,通过组成我们一般将之分为两类,一类叫做简单蛋白质,这种酶则是有它的结构来决定其活性,如胭酶、淀粉酶等;第二类则是结合蛋白质酶,这类酶想表现出自身的活性,则要加入一些非蛋白质组分(即辅助因子)。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。比如酪氨酸酶就是以铜离子为辅助因子的全酶。被酶作用的物质
8、称为这种酶的底物,而一般一种酶只会催化特定的的一种或一个类型底物的反应,具有很高的选择性和灵敏度,从而受到了广大分析者的重视。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是在生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分,用其他方法测定有困难,用酶法分析却有其独到之处。本论文是从马铃薯中提取出来酪氨酸酶,而后将其催化活性通过利用分光光度计来测定。土豆,香蕉,苹果等切开后暴露在空气中一段时间表面会变黑,是因为这些东西含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当把它暴露在空气中时,在氧气的参与下,便会发生一系列反应3主要的反应过程见图1。C(K)HCooHHOFig.lThereactio
9、n process of casease由于多巴试剂第一步转成多巴红的反应要比下一步产物的速率快得多,因此我们可以利用这个特性通过测定多巴转换成多巴红的速率而间接的测定酶的活性”L因为多巴红具有特殊的颜色,所以我们可以利用分光光度法来测定,通过不一样的时间测得的其中一个波长下的吸光度,以吸光度作为竖轴,时间作为横轴来构建坐标系,而后从算出的直线斜率中求出酶的活性。酶的活性一般定义为在适宜的条件下(一般包括PH值、离子强度、温度等),20时在1min内转化1mol底物所需要催化剂的量为活性单位。从下面的式子中我们可以计算出酶的活性:=106,式中,。为我们所使用的溶液ktv的酶的活性,A则是最大
10、吸收波长是的吸光度的变化,1为时间(min),k为多巴红的摩尔吸收系数,P为加入酶的体积,进而计算出原料(土豆)中酶的活性:aVom.式中A为原料中酶的活性(注意此处A不是吸光度用,/为原料所得的酶溶液的总体积,m为原料总质量。2材料与方法1.1 材料仪器:分光光度计(含比色皿)(722型)、离心机(TG16C)电子天平(BLXK-JA3003B)组织捣碎机(JJ51-JJ-2)、酸度计试剂:多巴(二羟苯丙氨酸)、磷酸氢二钠(分析纯)、盐酸(36%)、酪氨酸、市售新鲜马铃薯、去离子水。1.2 方法2 .2.1酪氨酸酶的提取取新鲜土豆,清洁干净后切碎,用天平称取10.Og放在研钵中,加入7.5m
11、LpH=7.2的磷酸缓冲溶液,用力研磨,然后用双层纱布收集滤出提取液,立即使用高速离心机高心分离5min,倾出上层清液保存于冰箱中,提取液为棕色,在放置过程中不断变黑。3 .2.2酪氨酸最大吸收波长确定:取2.5mL酶提取液用pH值为7.2的缓冲溶液将其稀释至IOmL,摇匀后取出0.4InL已稀释的土豆提取液,加入2.6mLpH值为6.0的磷酸缓冲溶液,加入2.OmL酪氨酸溶液,摇匀。反应5min后,使用紫外分光光度计扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。4 .2.3酪氨酸酶的活性测定:分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml稀释过的提取液用PH值7.2的磷酸缓冲液稀释至100ml并摇匀。然
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- 土豆 酪氨酸 提取 及其 催化 活性 研究

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