免疫组织化学染色SP技术课件.ppt

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1、武汉大学病理教研室,免疫组织化学的应用,IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。,武汉大学病理教研室免疫组织化学的应用,武汉大学病理教研室,实验名称,链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达,武汉大学病理教研室实验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法,武汉大

2、学病理教研室,S-P法原理示意图,过氧化物酶,链酶亲和素,生物素,生物素化二抗,特异性一抗,待测抗原,武汉大学病理教研室S-P法原理示意图过氧化物酶链酶亲和素生物,武汉大学病理教研室,免疫组织化学基本实验流程,武汉大学病理教研室免疫组织化学基本实验流程组织、细胞标本,武汉大学病理教研室,具体步骤如下：1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；2所有组织均采用微波修复抗原； 3室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；4滴加50l过氧化物酶阻断液（试剂A），37湿盒孵育 10min；50.01M PBS（pH 7.4）漂洗35mi

3、n；6滴加非免疫性动物血清（试剂B），37湿盒孵育 10min；,武汉大学病理教研室具体步骤如下：,武汉大学病理教研室,7甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；8滴加生物素标记的二抗（试剂C），37湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；9滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37湿盒孵育 15min，甩去多余液体；10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染；11常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；12阳性对照采用已知阳性

4、片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。,武汉大学病理教研室7甩去多余血清，分别滴加种抗体，4,武汉大学病理教研室,实验流程中的注意事项,内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染,武汉大学病理教研室实验流程中的注意事项内源性过氧化物酶的灭活,武汉大学病理教研室,染色前处理 取材、脱水、浸蜡,组织及时固定 固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛常规下固定8-24小时取材厚度：2mm,武汉大学病理教研室染色前处理 ,武汉大学病理教研室,染色前处理 预防脱片,常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数

5、 2）玻片洁净度,武汉大学病理教研室染色前处理,武汉大学病理教研室,染色前处理 包埋与切片,包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62切片：厚度 3-4m 烤片：温度60，时间1小时；或602小时（迈新）；或60过夜,武汉大学病理教研室染色前处理,武汉大学病理教研室,染色前处理 切片保存,切片不宜长时间在常温下保存,武汉大学病理教研室染色前处理,武汉大学病理教研室,染色前处理 脱腊,原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开,武汉大学病理教研室染色前处理,武汉大学病理教研室,实验操作中的应用,抗原修复 实验操作中的注意事项,武汉大学病理教研室实验操作中的应用抗原修复,武汉大学病理教研室,抗原修复

6、,影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1）酶消化法 2）加热法（高压法水煮法微波法）抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）,武汉大学病理教研室抗原修复 影响染色结果的最关键因素,武汉大学病理教研室,内源性过氧化物酶的灭活,存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟,武汉大学病理教研室内源性过氧化物酶的灭活 存在部位：红细胞、,武汉大学病理教研室,血清封闭,目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用,武汉大学病理教研室血清封闭 目的：减

7、少非特异性着色,武汉大学病理教研室,冲 洗,一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗增加效果 可加入Tween20,武汉大学病理教研室冲 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7,武汉大学病理教研室,一抗孵育时间及抗体选择,应选择信誉高、质量好的试剂公司抗体切忌反复冻融一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度按说明书可采用 37 1-2 小时或 4 冰箱过夜,武汉大学病理教研室一抗孵育时间及抗体选择应选择信誉高、质量好,武汉大学病理教研室,检测及显色系统,一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。如SP、LSABC、ABC等 显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测,武汉大学病理教研室

8、检测及显色系统一般采用以生物素标记的辣根过,武汉大学病理教研室,显色系统,常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT-蓝紫色,武汉大学病理教研室显色系统常用的酶,武汉大学病理教研室,复 染,原则：注意两者之间对比，突出阳性信号,武汉大学病理教研室复 染原则：注意两者之间对比，突出阳性信,武汉大学病理教研室,实验对照设计,原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照,武汉大学病理教研室实验对照设计原则：所有检测指标均设阳性对照,武汉大学病理教研室,结果分析,1.特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。2.染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多少。,武汉大学病理教研室结果分析1.特定的定位,武汉大学病理教研室,3.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。4.避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。,武汉大学病理教研室3.颗粒性显色,