免疫组化的基本原理和相关技术问题课件.pptx

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1、免 疫 组 织 化 学Immunohistochemistry (IHC),MD Ph.DDepartment of PathologyKey Lab. Of Antibody Technique, Ministry of HealthTel:86862739(L) 86863100(O)e-mail:,免 疫 组 织 化 学MD Ph.D,免疫组织化学 刘彦仿 主编 人民卫生出版社免疫细胞化学与核酸杂交技术 蔡文琴 王伯云 主编 四川科技出版社免疫组织化学新编纪小龙主编人民军医出版社,免疫组织化学,第一章 免疫组织化学基本原理及相关知识,第一章,用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原

2、（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。,蛋白质 磷脂多肽 多糖核酸 受体酶 病原体激素,蛋白质 磷脂,免疫组织化学技术的突出优点： 高度的特异性 敏感性高 方法步骤统一 机能和代谢密切结合， 定性、定位、定量的统一,免疫组织化学技术的突出优点：,免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。,免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚, 基因探针 核酸分子杂

3、交技术 原位PCR技术 核酸杂交和免疫组织化学双标记 电镜杂交技术, 基因探针,核酸分子探针-杂交-免疫组织化学放大和显示杂交信号杂交免疫组织化学,核酸分子探针-杂交-免疫组织化学,基因重组技术 免疫组织化学 图像分析单抗技术 技 术 流式细胞术 激光共聚焦显微术,基因重组技术 免疫组织化学 图像分析,免疫组织化学的全过程：抗原的提取和纯化免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）抗体效价检测和提取、纯化标记抗体细胞、组织切片标本的制备免疫组织化学反应和显色观察和记录结果,免疫组织化学的全过程：,第二章 免疫组织化学中的技术问题,第二章,技术问题的重要性,技术问题的重要性,第一节 有关的细胞和组织学技术

4、,第一节 有关的细胞和组织学技术,一、取材（一）细胞标本的取材 印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 细胞数量多：直接涂片 细胞数量少：离心沉淀涂片,一、取材, 培养细胞 直接收集 培养液离心涂片, 培养细胞,（二）组织标本的取材 活检钳的刀口必须锋利，以免组织受挤压 取材部位必须是主要病变区 必须取病灶与正常组织交界处 必要时取远离病灶区的正常组织作对照,（二）组织标本的取材,新鲜组织 冰冻切片 液氮保存 -70冰箱,新鲜组织,二、固定固定剂：常用醛类固定剂 10%福尔马林（甲醛10ml + 蒸馏水90ml） 10%中性缓冲福尔马林（甲醛10ml + 0.01mol/L pH7.4 PBS

5、 90ml ） 2.5%戊二醛 用于电镜 丙酮 用于冰冻切片、细胞涂片 4,二、固定,2022/12/29,21,可编辑,THANK YOUSUCCESS2022/10/22,固定方法： 浸入法 灌注法,固定方法：,三、切片 1. 石蜡切片 2. 冰冻切片 3. 塑料切片 4. 超薄切片,三、切片,四. 玻片处理和涂胶 载玻片和盖玻片处理 盖玻片、载玻片 清洁液中浸泡24h（硫酸 + 重铬酸钾）清水冲洗蒸馏水冲洗95%酒精浸泡24h烘干,免疫组化的基本原理和相关技术问题课件,载玻片涂粘附剂: APES 多聚赖氨酸,载玻片涂粘附剂:,第二节 免疫组化染色中的技术问题,第二节 免疫组化染色中的技术

6、问题,一、抗体 新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。,一、抗体,1. 抗体贮存 2. 抗体稀释 按不同的免疫染色方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。,1. 抗体贮存, 抗体最佳稀释度的测定方法 二抗 一 抗 1 1:50 1:100 1:200 1:400_ 1:50 + + + 1:100 + + + 1:200 + + 1:400 _, 抗体最佳稀释度的测定方法, 以中等阳性稀释度为佳 抗体稀释液的配制 0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS, 以中等阳性稀释度为佳,3抗体的选择 (1) 多抗：虽然存

7、在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。 (2) 单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。,3抗体的选择,多抗？单抗？抗原表位的丰富程度也可应用多个单抗（a cocktail of monoclonal antibodies）解决抗原表位少的问题,多抗？单抗？,二、免疫染色 一般程序： 标记抗体与标本中的抗原反应结合 用PBS洗去未结合的部分 直接观察结果（免疫荧光）或显色后再用显微镜观察（免疫酶）,二、免疫染色,1. 增强特异性染色的方法 蛋白酶消

8、化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 合适的抗体稀释度 第一抗体 温育时间 37 30-60 min, 4 过夜 多层染色法（双层、三层）,1. 增强特异性染色的方法,2. 减少或消除非特异性染色的方法 加二抗动物的正常血清 2%5%牛血清白蛋白,2. 减少或消除非特异性染色的方法,3. 显色反应的控制 显色剂的浓度、温育时间4. 复染,3. 显色反应的控制,三、对照 阳性对照 阴性对照 阻断试验 替代对照 空白对照 自身对照 吸收试验,三、对照,四、免疫组织化学染色结果的判断 阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞核、细胞膜表面,四、免疫组织化学染色结果的判断, 阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性 由于细胞内

9、抗原含量不同，所以染色强度不一, 阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性, 阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。 切片边缘、刀痕或皱折区域 、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。, 阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。,经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Will Be,写在最后,经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量写,感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings,结束语,讲师：XXXXXX XX年XX月XX日,感谢聆听结束语讲师：XXXXXX,