免疫组化双重染色技术培训课件.ppt
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1、二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490495520530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.,1,二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体,3. 观察: 同一个视野里.a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重
2、叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.,2,3. 观察: 同一个视野里.免疫荧光双重染色法: FITC绿,B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自不同种属的动物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗,兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色程序:a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第一种抗原; 然后再用
3、第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后孵育切片, 最后用荧光显微镜观察.,3,B. 间接法: 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和T,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.,4,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合,Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechs
4、t blue,5,Y.W Lin. USP26 stained by Alex,三. 免疫酶双重染色A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所费时间较长.,6,三. 免疫酶双重染色6,抗体, 酶和反应产物洗脱,7,抗体, 酶和反应产物洗脱7,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次
5、序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原.c. 先用不太敏感的抗体.d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照.b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.,8,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合,5. 抗体洗脱:a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓冲液(可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)14小时使抗原-抗体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分, 氧化除去抗体,
6、0.5% Na2S2O5漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种抗原的影响.c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80烤箱14小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.,第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标.,9,5. 抗体洗脱:第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试,6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次510分. *.
7、氧化法洗脱. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗如上. 甘油胶封片.,10,6. 具体操作步骤: 10,一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色,11,一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色 11,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫酶(PAP法)双重染色.,12,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色),b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部位. 用有机溶剂将反应终产物溶解除去, 并将第一次染色形成的抗体复合物洗脱掉, 然后进行第二次染色. 对同一部位再一次照
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