免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训课件.ppt

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1、免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,Part I 补体参与的反应 补体的溶血反应 Part II T细胞数量及其功能检测 E花环形成试验数量测定 淋巴细胞转化试验： 形态学方法 3HTDR掺入法 MTT比色法,功能,2,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,Part I 补体参与的反应功能2免疫学补体参和反应,Part I 补体参与的反应,复习,3,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+,1.补体的溶血反应,原理 绵羊红细胞（SRBC ）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激

2、活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。 材料 1抗原：2%绵羊红细胞； 2抗体(溶血素)； 3补体：健康豚鼠新鲜血清 4生理盐水、24孔板等。,4,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,1.补体的溶血反应 原理4免疫学补体参和反应T细胞数量和其,步骤,1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、将24孔板放在37温箱内15-30min，观察并记录结果。,结果:,5,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,孔号 SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6,Part II T细胞数量及其功能检测,6,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,Part II T细胞数

3、量及其功能检测6免疫学补体参和,2.E花环形成试验,原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。,检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。,7,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,2.E花环形成试验 原理 检测T细胞数量，间接判断机体的,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训课件,步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！）,取肝素抗凝血与等量Hanks液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰） 配平后1800rpm离心13mins

4、。,1.淋巴细胞悬液的制备：,人淋巴细胞比重：1.070淋巴细胞分层液：1.077人红细胞比重：1.092,9,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！,10,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,稀释的血液 离心前稀释的血浆 离心后10免疫学补体参和反应T,11,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,11免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测, 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHanks液的试管2000rpm离心5mins。(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hanks

5、液5ml，重复离心两次。2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）轻弹混匀后放于37温箱15mins。,离心时要配平,12,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测, 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的,3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mins4. 吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5. 取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片

6、。,13,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关,6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合3个SRBC者为E花环阳性。,正常参考值：EtRFC：64.46.7； EaRFC：23.63.5； EsRFC：3.32.6,14,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴,结果,T 淋巴细胞,SRBC,15,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,结果T 淋巴细胞SRBC15免疫学补体参和反应T细胞数量,16,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能

7、检测,16免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,淋巴细胞转化试验 ,原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法形态学方法、 3H-TdR掺入法、 MTT比色法,17,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,淋巴细胞转化试验 原理17免疫学补体参和反应T细胞数,根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，

8、胞浆少、染色为轻度嗜碱性；过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁12个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。,形态学方法：镜下观察 淋巴细胞转化试验,18,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造,淋巴细胞转化率：,正常参考值：80,红细胞,未转化淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 1040,19,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化

9、的淋巴细胞未转化的淋巴细,20,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,20免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,3HTDR掺入法 淋巴细胞转化试验,T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。,21,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,3HTDR掺入法 ,MTT比色法 淋巴细胞转化试验,MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成

10、甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。,22,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,MTT比色法 淋巴细胞转化试验,MTT,Formazan,Insoluble,23,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,MTT Formazan Insoluble23免疫学,1. 补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。2. E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。3. 绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察结果。,实验报告,24,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,1. 补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。实验报告24免疫,第4次 实验课内容,免疫标记技术：ELISA免疫病理实验实验课考试,25,免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测,第4次 实验课内容免疫标记技术：ELISA25免疫学补体参,