免疫化学诊断技术的分类与局限课件.ppt

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1、利用抗原抗体反应和分离技术测定(量)与疾病有关的化学分子。,免疫化学診斷技术,利用抗原抗体反应和分离技术测定(量)与疾病有关的化学分子。免,免疫同位素标记測定法化学发光法酶联化学发光偏振荧光时间分辨荧光电化学发光直接化学发光,免疫化学診斷技术的分类,免疫同位素标记測定法免疫化学診斷技术的分类,免疫同位素标记測定法,放射免疫法已有30多年历史。比较其它传统的方法，它有特异性好，灵敏度高，准确性好，可靠性强等特点，故在临床科研上广泛使用。,免疫同位素标记測定法放射免疫法已有30多年历史。比较其它传统,免疫同位素標記法之局限,半衰期短 ；試劑批內与批間差异大；反應過程長；靈敏度有限；放射性廢物的處理

2、；,免疫同位素標記法之局限 半衰期短 ；,免疫化学发光法,酶联化学发光 偏振荧光 时间分辨荧光 电化学发光 直接化学发光,免疫化学发光法 酶联化学发光,免疫化学发光法简介 - 酶联化学发光 (EMCLIA),原理：抗体包被的塑料固相加入待测样本 - 抗原加入碱性磷酸酶标记的抗体洗加入底物 - 4-Mup, 发光产品：雅培Axsym, 梅里埃Vidas, 强生Vitros, DPC Immulite 2000, 罗氏ES300,免疫化学发光法简介 - 酶联化学发光 (EMCL,原理：標記在小分子抗原上的熒光素經485nm的激發偏振光照射後，發出光子，經過偏振儀形成525550nm的偏振光；這一偏

3、振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比，游離的熒光素標記抗原，分子小，轉動速度快，激發後發射的光子散向四面八方，因此偏振光信號弱；在測定過程中待測抗原小分子，熒光標記抗原小分子和特導性沆體大分子同時加入到一反應杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結合的量越少，而熒光標記抗原與抗體結合就越多，而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合後，其分子的轉動速度減慢，由此熒光偏振信號強。产品：雅培Axsym,免疫化学发光法简介 - 偏振荧光 (FPIA),原理：免疫化学发光法简介 - 偏振荧光 (F,原理：标记物为三價稀土離子如：銪 (Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等，它們可利

4、用具有雙功能基團結構的螫合劑，在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合，形成稀土離子螫合劑抗原結合物。當標記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結合，形成抗原抗體免疫復合物，其中含有標記稀土離子，然後利用時間分辨熒光分析儀，可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度，以此確定待測抗原的含量。产品：EG&G的DELFIA,免疫化学发光法简介 - 时间分辨荧光 (TRFIA),原理：免疫化学发光法简介 - 时间分辨荧光 (TRF,原理：先將特异性抗體包被在磁性微珠。另外將發光劑Ru (bpy)32+標記在特异性抗體上。將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育，形成磁性微珠包被抗體抗原發光劑標

5、記杭體復合物。加入TPA緩沖液和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光。产品：罗氏Elecsys,免疫化学发光法简介 - 电化学发光 (ECLIA),原理：免疫化学发光法简介 - 电化学发光 (E,免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA),原理：利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的測定方法。以丫啶酯為發光的標記物，固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾心法和競爭結合法相似。單克隆抗體或抗原包被磁性微粒抗原抗體結合，洗滌分離加入氧化劑發光：經過加入氧化劑（H2O2）和 pH 糾正液（NaOH）使成鹼性，這時丫啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發光

6、，集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內所產生的光子能。产品：拜耳ACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMS,免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA,全 自 動 化 學 發 光 系 統拜耳 ACS(Automated Chemiluminescence System),免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA),全 自 動 化 學 發 光 系 統免疫化学发光法简介,直接化學發光的机理 - ACRIDINE ESTER丫啶酯,最 簡 易 最 快 速,非常稳定；与抗体或抗原结合不影响发光；,N,+,CH,3,Br,C,O,O,CH,3,CH,3,R,丫啶

7、酯 ：在pH10时，快速充分释放光子。,直接化學發光的机理 - ACRIDINE,丫啶酯 - ACRIDINE ESTER,不需催化劑 穩定性高 產光強 線性好 本底低 反應快 結合后不影響發光 靈敏度高 - 可達10-15 摩爾,直接化學發光的机理,丫啶酯 - ACRIDINE ESTER不需催化劑直接化學,丫,丫,啶,啶,酯,酯,一,一,秒,鐘,直,直,接,接,閃,閃,光,光,，,，,強,強,度,度,是,是,碘,碘,125,125,在,在,一,一,分,分,鐘,鐘,發,發,出,出,光,光,子,子,的,的,十,十,万,万,倍,倍,0,6.0,5.0,2.0,1.0,0,200,000,400,

8、000,600,000,800,000,1,000,000,3.0,4.0,秒,100,200,300,400,500,600,直,接,閃,光,慢,發,光,光,強,度,直接化學發光的机理,丫丫 啶啶 酯酯 一一 秒 鐘 直直 接接,直接化學發光的机理,由,于,超,低,本,底,直,接,化,學,發,光,具,有,高,靈 敏,性,Tracer Concentration (moles/L),sensitivity limit,of fluorescence,sensitivity limit of,chemiluminescence,Fluorescence,Background Noise Leve

9、l,10,10,9,9,8,8,7,7,6,6,5,5,4,4,3,3,2,2,1,1,0,0,10,10,-15.5,10,10,-17,10,10,-16,10,10,-15,10,10,-14,10,10,-13,10,10,-12,10,10,-10,10,10,-9,10,10,-8,10,10,-11,tracer signal,直接化學發光的机理由 于 超 低 本 底,直 接,直接化學發光的机理,直,直,接,接,化,化,學,學,發,發,光,光,不,不,受,受,pH,pH,和,和,溫,溫,度,度,影,影,響,響,n,n,減輕漂移,減輕漂移,n,n,提高重复性,提高重复性,0,0,2

10、0,20,40,40,60,60,80,80,100,100,120,120,8,8,9,9,10,10,1,1,1,1,12,12,13,13,pH,pH,pH,pH,Temperature Degrees C,Temperature Degrees C,120,120,100,100,80,80,60,60,40,40,20,20,0,0,15,15,20,20,25,25,30,30,35,35,40,40,直,接,閃,光,慢,慢,發,發,光,光,直,直,接,接,閃,閃,光,光,慢,慢,發,發,光,光,Relative,Relative,LIght,LIght,Intensity (%)

11、,Intensity (%),溫,溫,度,度,Relative,Light,Intensity,直接化學發光的机理直直 接接 化化 學學 發發 光,直接化學發光与电化學發光比较,丫啶,酯直接發光,CL(AE),電,化,學,發,光,ECL(TU + TPA),信,號,的,產,生,丫啶,酯,与,H,2,O,2,的,簡,單,反,應,需,三,個,電,板,去,激,發,由,几,個,分,子,態,參,加,的,复,雜,反,應,速,度,不,到,2,秒,5,秒，,但,洗,電,极,需,40- 60,秒,靈,敏,度,10-,15,M,，足,以,滿,足,免疫,試,驗,的,要,求,10,-11,-,10-,17,M,本,底

12、,极,低,較,高，過,剩,的,TPA,會,發,光,特,异,性,不,受,溫,度,与,pH,的,影響,受,pH,金,屬,及,螯,合,物,影,響,丫啶 酯直接發光CL(AE)電 化 學 發 光 ECL(T,微顆粒,粗顆粒,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,功能抗原抗体反應相結合与未結合的分离特點縮 短 擴 散 距 离 提 高 捕 獲 效 率 表 面 面 積 為 包 覆 的 試 管 和 玻 璃 珠 之 50倍 有 利 于 結 合 動 力 學提 供 更 高 之 靈 敏 度,微磁顆粒技術,微顆粒粗顆粒 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY,扁平的設計,結合相,磁場,狄窄空間以利快速抽

13、吸,吸液探針,以 便 最 怏 速 , 最 干 凈 地 分离 結 合 物 与 未 結 合 物 以 便 獲 得 高 靈 敏 度 及 高 重 复 性,試 杯 的 最 佳 設 計 - 配 合 微 磁 粒 体 技 術,扁平的設計結合相磁場狄窄空間以利快速抽吸吸液探針以 便 最,降 低 人 抗 鼠 抗 体 (HAMA) 的 干 扰為 大 分 子 的 測 定 提 供 了 高 靈 敏 度 和 高 特 异 性,單 抗,多 抗,直 接 發 光,FSH,反应过程的结构设计 - 單 - 多 抗 体标记法,降 低 人 抗 鼠 抗 体 (HAMA) 的 干 扰為,是 一 种 确 保 高 靈 敏 度 同 時 又 廣 譜 的

14、 設 計,BGG,BGG,直 接 發 光,反应过程的结构设计- 抗体 一 步 標 記 法,磁颗粒,是 一 种 确 保 高 靈 敏 度 同 時 又 廣 譜 的,ACS:180 SE 之 特 性,隨 机 存 取 直 接 化 學 發 光 台 型 設 計 180 測 試 /小 時 十 五 分 鐘 內 首 次 結 果 自 動 重 复 功 能自 動 机 內 稀 釋 凝 塊 識別兼 容 原 樣 品 試 管 條 碼 識 別 60 個 樣 品 容 量,緊 急 樣 品 容 納 机 上 容 納 十 三 种 項 目 試 劑 清 單 微 量 固 相 廢 物 質 控 報 告 儲 存 机上儲存質詢，電影演示一小時离机雙 向

15、 界 面 宿 主 詢 問廣 譜 試 驗 項目系列 實 驗 室 自 動 化 匹 配,ACS:180 SE 之 特 性隨 机 存 取 緊 急 樣,臨 床 應 用 项目 按 疾 病 分 類,甲 狀 腺 功 能 T4, T3, TUp, FT4, FT3, TSH, TSH-3生 殖 系 統 ThCG, LH2, FSH, Estradiol, Estradiol6-II, Progesterone, Prolactin, Testosterone內 分 泌 Cortisol (serum+urine)貧 血 B12, Ferritin, Folate, RBC Folate心 血 管 CK-MB,

16、Myoglobin, Troponin I,腫 瘤 標 記 CEA, AFP, PSA2, fPSA, CA15-3 , CA125, CA19-9 藥 濃 度 監 測 Digoxin, Theophylline, Phenobarbital, Phenytoin, Vancomycin, Gentamicin, Digitoxin, Carbamazepine 骨 代 謝 Deoxypyridinoline 過 敏 Total IgE,臨 床 應 用 项目 按 疾 病 分 類甲 狀 腺 功 能,發 展 中 新 項 目,Insulin, C-peptide, anti-insulinDHEA-

17、SulfateSHBGTobramycin, QuinidineHomocysteinebeta-2 microglobulin E3Anti-TPOAnti-TGEquimolar PSAComplex PSAHER-2/neu,發 展 中 新 項 目 Insulin, C-peptide,免疫化學定量分析之進化,2.5 hours0.12 U/mL,79年IRMA,50 minutes.03 U/mL,88年半自動Magic,7.5 minutes.03 U/mL,91年ACS:180,2 days1.0 U/mL,70年代中商業化RIA,5 days1.0 U/mL,60年代初研究RIA

18、,以 TSH 甲狀腺刺激素試驗為例,免疫化學定量分析之進化2.5 hours79年50 minu,免疫化學方法靈敏度之提高,10-16 M,10-11 M,10-12 M,免疫熒光,免疫媒標,放射免疫,直接化學發光,10-11 -10-17 M,免疫傳感技術免疫PCR技術,? M,電化學發光,免疫熒光偏振,免疫化學方法靈敏度之提高 10-16 M10-11 M10,ACS:180 系 列 發 展 史,1974 - 首創微玻璃珠放免法 1978 - 首次FT4 放免法1979 - 首次 TSH 放免法1982 - 首次維生素12/葉酸固相法1983 - MAGIC 上市1986 - 首次直接化學

19、發光免疫分析儀 - MAGIC LITE1991 - 首次全直動隨机存取之化學發光免疫分析儀 - ACS1992 - 首次全直動維生素12/葉酸測定1993 - 延長操作附件1994 - 首次凝塊探測功能1994 - ACS通過ISO9001標准,ACS:180 系 列 發 展 史 1974 - 首創微玻璃,心血管系统,如何能,更快,更准确,更全面的,诊断AMI,心血管系统如何能更快更准确更全面的诊断AMI,时心电图并不能典型归类,诊断急性心肌梗塞之困难,一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入 院,病人重发梗塞诊断困难,引致不能及时诊断AMI,延迟适当的治疗、护理,临床需要,尽早分辨、准确诊断AMI

20、方法,时心电图并不能典型归类诊断急性心肌梗塞之困难 一半有不稳定,肌肉组织,心肌,心肌细胞特异性标志,肌钙蛋白,I,C,T,肌钙蛋白 I,释放入血,c,心肌坏死,（氨基酸顺序40差异）,肌肉组织心肌心肌细胞特异性标志肌钙蛋白 I C T肌钙蛋,心肌细胞,肌红蛋白,肌酐激霉MB,心肌坏死,释放入血,（含量大）,血液浓度明显升高,(CK-MB),心肌细胞肌红蛋白肌酐激霉MB心肌坏死 释放入血（含量大）血,654321,0 4 8 12 16 20 24 48 72 96 h,肌红蛋白,CK-MB,肌钙蛋白,浓度,急性心肌梗塞后各项指标变化,60 4 8 12 16 20 24,肌红蛋白,升高,高峰

21、,回落,肌酐激霉MB,肌钙蛋白I,1-2 h,4-8h,6-8h,5-12h,10-24h,12-24h,18-30h,48-72h,5-7d,肌红蛋白升高高峰回落肌酐激霉MB肌钙蛋白I1-2 h4-8h,肌红蛋白的临床意义,早期诊断,特异性低,灵敏度高,急性心梗后最早(1-2h)出现的标记,最早能排除非急性心梗,阴性预测率为 99 %,体内周期短，对重发梗塞特别灵敏,肌红蛋白测定能有效分辨非急性心梗，使急性心梗病人能尽早得到治疗.,有效观察溶栓疗效,肌红蛋白的临床意义 早期诊断 特异性低 灵敏度高急性心梗后最,肌钙蛋白I的临床意义,诊断急性心肌梗塞特异性 98 %,特异性强、确诊率高,灵敏度

22、低,急性心梗发病后6 h才出现，应与肌红蛋白一同使用,肌钙蛋白I升高即可确诊为急性心肌梗塞，得到治疗,体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断,对极轻微的心肌创伤都能检出,肌钙蛋白I的临床意义诊断急性心肌梗塞特异性 98 % 特,胸痛,ECG,发病,肌钙蛋白I,肌红蛋白CK-MB,急性心梗,+,+,+, 8h, 8h,随访,+,复发心梗,胸痛ECG发病肌钙蛋白I肌红蛋白急性心梗+,肌红蛋白,注意事项,肌酐激霉MB,骨骼肌损伤肌红蛋白升高,肾功能衰竭 CK-MB 增高,肌红蛋白注意事项肌酐激霉MB骨骼肌损伤肌红蛋白升高肾功能衰,甲状腺功能诊断,T3 T4 TSH TSH-3,FrT3 FrT4 T

23、up,甲状腺功能诊断 T3 FrT3,肿瘤标志物,CA-199 CA-153 CA-125,PSA AFP CEA,肿瘤标志物 CA-199 PSA,CA 系列 一组糖粘蛋白类肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因分别被鼠单克隆抗体199、153、125识别得名。,CA 系列 一组糖粘蛋白类肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂,乳癌肿瘤标志物,存在于胎儿胰、肠、卵巢、子宫、胆上皮等处及乳腺癌组织。,CA 125,存在胚胎体腔上皮细胞中，出生后消失，卵巢癌细胞中重新出现。,卵巢癌肿瘤标志物,CA 199,分布于胎儿胰、胆囊、肝、肠及正常人胰、胆管上皮等处。,胃肠癌肿瘤标志物,CA 153,乳癌肿瘤标志物存在

24、于胎儿胰、肠、卵巢、子宫、胆上皮等处及乳腺,CA 199 检测的临床意义,消化道肿瘤的诊断,胰癌 81.8%肝癌 78.5%胃癌 59.4%肠癌 58.6%,消化道肿瘤疗效观察的指标,CA 199 检测的临床意义 消化道肿瘤的诊断胰癌,CA 153 检测的临床意义,乳腺癌的诊断,乳腺癌术后疗效观察、复发监测,阳性率 5055%,与分期有关, 20.7%, 57.1%, 75.6%,结肠、胰腺、卵巢、子宫癌可升高,CA 153 检测的临床意义 乳腺癌的诊断 乳腺癌术后疗效观,CA 125 检测的临床意义,卵巢癌的筛查和诊断,卵巢癌疗效观察的指标,卵巢癌 82 %,卵巢良性病 6 %,术后CA12

25、5升降标志着肿瘤的复发与痊愈，符合率为8593%。,卵巢癌预后的判定指标,CA 125 检测的临床意义 卵巢癌的筛查和诊断 卵巢癌疗效,前列腺特异抗原 (PSA),PSA是唯一由前列腺上皮产生的单体糖蛋白,前列腺增生症可有PAS轻度增高,PAS明显升高是癌肿浸润进展的标志,有助于前列腺癌的临床分期和疗效观察,敏感性 87.8% 特异性 70.2%,前列腺癌的筛选指标之一,前列腺特异抗原 (PSA)PSA是唯一由前列腺上皮产生的单体,骨型胶原,脱氧吡啶啉,(Deoxypyridinoline),释放入血,经尿排出,吸收、分解,反映骨吸收率的生化指标,骨代谢,DPD,骨型胶原脱氧吡啶啉(Deoxy

26、pyridinoline)释,骨质疏松症,骨形成率,骨吸收率,骨代谢负平衡,尿DPD明显升高,骨量减少,骨质疏松症 骨形成率骨吸收率骨代谢负平衡尿DPD明显升高骨,骨质疏松症的疗效观察,DPD 25%,DPD 25%,疗效好、维持治疗,疗效差、调整治疗,骨质疏松症的疗效观察DPD 25,生殖系统,HCG,FSH,LH,PRL,E2,T,P,生殖系统 HCG FSH LH PRL E2 T P,地高辛 洋地黄 茶碱 苯妥英,苯巴比妥 可马西平 万古霉素 庆大霉素,药物浓度监测,地高辛 苯巴比妥药物浓度监测,铁蛋白 (Ferritin),血液系统,维生素B12,叶酸 (Folate),红细胞叶酸 (RBC Folate),铁蛋白 (Ferritin) 血液系统 维生素B12 叶酸,