免疫共沉淀原理和注意事项课件.ppt

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1、一 实验原理,以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。,问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？,Y-X-抗X,一 实验原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基,CO-IP应用与IP区别,测定两种目标蛋白质是否在体内结合确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）,CO-IP应用与IP区别,实验基本原理,1.提取蛋白2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体3.孵育

2、后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“YX抗X抗体Protein A或G3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）,roteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合,agarose bead 琼脂糖珠,实验基本原理1.提取蛋白proteinA/G有一个很重要的特,CO-IP原理图解,CO-IP原理图解,roteinA/G-琼脂糖珠复合物,Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。目前多用protein A/G

3、预先结合在argarose beads上。,roteinA/G-琼脂糖珠复合物Protein A是一种,ProteinA/G的作用及具体原理,“捕获”抗体，形成复合物， 抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beadsEP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。,ProteinA/G的作用及具体原理“捕获”抗体，形成复合物,二 CO-IP特征,优点（1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态（2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影

4、响（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物,二 CO-IP特征优点,二 CO-IP特征,局限性（1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；（3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。,二 CO-IP特征局限性,三 实验流程,提取细胞总蛋白 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) 离心去PA珠子，取上清 测蛋白浓度 (BCA法) 加一抗反应(4过夜) 加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4过夜) 离心，收集

5、沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 ,三 实验流程,四 实验结果分析,SDS-PAGEWestern blotting分析质谱分析检测目的蛋白,四 实验结果分析SDS-PAGE,SDS-PAGE结果分析,标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。,SDS-PAGE结果分析 标难曲线只对同一块,一抗,一抗,一抗(兔抗Actin),曝光后的蛋白条带,二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG),ECL,X光片曝光显影,ECL 试剂,含有转印蛋白的P

6、VDF膜,+,+,转印膜上蛋白检测示意图,WB结果分析,一抗一抗一抗(兔抗Actin) 曝光后的蛋白条带二抗 (辣根,CO-IP与质谱分析流程,CO-IP与质谱分析流程,三 实验的关键,1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？,三 实验的关键,注意

7、的问题：1.裂解液,细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。,注意的问题：1.裂解液 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破,RIPA裂解液-普利莱基因技术有限公司,100ml RIPA Buffer： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（100元）说明：1. 裂解液临用前可新鲜加入最

8、终浓度为1mM的PMSF或其它蛋白酶抑制剂。2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度,RIPA裂解液-普利莱基因技术有限公司100ml RIPA,裂解液成分,国内博士： 细胞裂解液： 50mM Tris-HC（lpH7.5）， 150 mM NaCl, 0.5%NP-40, 1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail（混合物）。 刘岩 BC300 buffer 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.2 mM E

9、DTA, 10% glycerol（甘油）, 0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20,裂解液成分 国内博士：,2.1免疫沉淀中抗体的选择,2.1免疫沉淀中抗体的选择,注意的问题：2.2抗体,使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）,注意的问题：2.2抗体使用对照抗体：（阴性和阳性）,未检测到目得蛋白或蛋白很少,可能原因 处理方法1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4以下冰上操作并防止冻融2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度3.抗抗体

10、亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液,未检测到目得蛋白或蛋白很少 可能原因,目得蛋白高背景：,可能原因 处理方法非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗， 免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体转移膜上的非特异吸附 戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜转移面,目得蛋白高背景：,试剂,RIPA Buffer蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、PMSF。洗涤缓冲液PBSProtein A agarose琼脂糖抗体,试剂RIPA Buffer,仪器、耗材,摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干）,仪器、耗材 摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管,免疫共沉淀原理和注意事项课件,