5章农药、兽药残留速测技术ppt课件.ppt

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1、,第五章 农药、兽药残留速测技术,农药中毒事件回顾,海南“毒豇豆”事件,2010年1月，海南豇豆在武汉白沙洲农副产品市场连续三次被检测出含有禁用农药水胺硫磷。随后在武汉、上海、郑州、合肥、杭州、广州等11个城市检测出海南豇豆农药残留超标。仅武汉销毁毒豇豆3596.9公斤,水胺硫磷，是一种高毒性农药，早在2002年，农业部已将它例如黑名单中，禁止在水果蔬菜、中草药植物上使用。它能经由食道、皮肤和呼吸道，引起人体中毒。,农药中毒事件回顾,青岛“毒韭菜”事件,2010年4月，青岛一些医院陆续接到9名食用韭菜后中毒的患者，他们都是食用韭菜之后出现了头疼、恶心、腹泻等症状，经医院检查属于有机磷中毒，也就

2、是说韭菜上的残余农药严重超标导致中毒。随后，检出农药残留超标韭菜1930公斤。,农药中毒事件回顾,张裕红酒农药超标事件,2012年8月7日某媒体报道：记者将三家国内葡萄酒上市公司的十款葡萄酒送国家食品质量监督检验中心检测，均检出多菌灵或甲霜灵农药残留，而张裕产品残留值超过另两家。多菌灵为美国禁用的农药，有导致肝癌的风险。张裕A股价直奔跌停，最终大跌9.83%,2001年，杭州的空心菜有机磷中毒事件。2003年，南京蔬菜有机磷残留导致中毒的事件。2007年，福建大田发生有机磷污染水源导致中毒事件。2008年1月，日本发生饺子中毒事件，该饺子被化验出含甲胺磷残留2008年1月9日，中国决定停止甲胺

3、磷、对硫磷等五种高毒农药的生产、流通和使用。 2011年3月，河南毒韭菜事件有机磷中毒(超标农药残留主要是甲拌磷),6,一、前言,随着人们环境意识的不断加强，由农药引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高农产品的质量安全水平，增强农业产品的国际竞争力，我国政府决定加强农产品中农药残留的监控，建立健全农药残留的检测体系，实施对蔬菜、瓜果、茶叶生产全过程的农药监控，从源头抓起，加强农产品的产地检测，把住农产品的市场准入关。,7,（一）农药概念 农药(pesticides) 是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草及其他有害生物，以及有目的地调节植物、昆

4、虫生长的的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。 现在农药不仅应用于农业，而且也广泛应用于畜牧业、林业和公共卫生事业等方面。,一、概述,8,（二）农药残留的概念,农药残留是指农药使用后残存于生物体、食品(农副产品)和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。,农药残留几乎无处不在！,土壤,水体,空气,农药,植物,动物,人,10,（三）农药的分类,1.按化学成分可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及砷、汞、铜、硫磺等制剂。 2.按用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂和粮食熏蒸剂等。,11,（四）农药的毒性及种类,农药除了可

5、造成人体的急性中毒外，绝大多数对人体产生的慢性危害，多是通过污染食品的形式造成。某些农药对人和动物的遗传和生殖造成影响，产生畸形和引 起癌症等方面的毒素作用。,我国农药的发展,20世纪80年代前，中国生产的农药尚不足80种，大多是进口，农药主要是有机氯。1983年禁止生产和使用有机氯农药后，代之以有机磷、氨基甲酸酯类农药，但其中一些品种比有机氯的毒性大10倍甚至100倍。90年代之后，中国逐渐由农药进口国变成出口国，近两年，农药进口量只相当于产量的2%-3%，出口量已是进口量的十几倍。,13,1、有机氯农药,品种： DDT、六六六、艾氏剂、狄氏剂等。特点：化学性质稳定，不易分解，易溶于脂肪中，

6、并在脂肪中蓄积，长期使用会严重的环境污染。,危害：有机氯农药容易积累在人体的脂肪、肝脏、肾脏等部位，并且不容易排除体外。DDT：当人体蓄积的浓度20mg/kg时，神经系统放生障碍，达到500mg/Kg时，可以致死。动物实验证实有致畸、致癌作用 目前许多国家都已禁止使用，我国已于1983年全部禁止生产和使用。,15,六六六，BHC,滴滴涕，DDT,16,滴滴涕：减少了蛋壳的厚度，从而降低了小鸟的孵出率。二恶英：进入机体后几乎不被排泄、沉积在肝脏和脂肪组织中。属于剧毒物质，毒性比氰化钾高130倍，致癌毒性比黄曲霉毒素高10倍，会引起基因突变，影响繁殖力和智力发育。,17,早期的高效高毒品种：对硫磷

7、（1605）、甲拌磷（3911）、内吸磷（1059）后期使用得较多的为高效低毒低残留的品种，如：乐果、敌百虫、杀螟松、倍硫磷毒性极低的马拉硫磷、双硫磷、氯硫磷、锌硫磷、碘硫磷、地亚农、灭蜈松,2、有机磷农药,18,有机磷农药主要品种,甲胺磷,乙酰甲胺磷,19,乐 果,一六0五,20,急性毒性：有机磷农药化学性质不稳定，分解快，在作物中残留时间短，大多不溶于水、碱性条件下易水解而失效 。危害：有机磷类农药的中毒特征是抑制血液和组织中胆碱酯酶的活性，导致神经系统机能失调, 从而使一些受神经系统支配的脏器, 如心脏、支气管、肠、胃等发生功能异常。,21,主要表现为植物性食物残留，尤其是含有芳香物质的

8、植物如：水果、蔬菜，特别是叶菜类如小白菜、大白菜、鸡毛菜、甘蓝、芹菜、韭菜、芥菜、花菜、绿花菜、茼蒿、枸杞菜和黄瓜等,22,3、氨基甲酸酯类农药,是目前使用量较大的杀虫剂。品种：西维因、杀灭威、速灭威、叶蝉散等在作物上的残留时间为4d，在动物的肌肉和脂肪中的明显蓄积时间约为7d特点：分解快、残留期短、低毒、高效、选择性强危害：同有机磷农药,23,氨基甲酸酯类农药是农药急性中毒的主要原因，也是时下蔬菜中农药残留的重点检测品种。 氨基甲酸酯类农药的中毒原因与有机磷农药相同，也是抑制人体内胆碱酯酶，从而影响人体内神经冲动的传递。 氨基甲酸酯类杀虫剂进入人体内，在胃中酸性条件下可与食物中的亚硝酸盐和硝

9、酸盐反应生成亚硝基化合物，具有致癌性。,我国农药在农产品的用量居高不下 导致农产品中的农药残留超标食品安全、影响消费者健康、影响农产品的贸易加强农残检测,不合理使用,（五）传统农残分析技术一般过程,（六）传统农残分析技术的优缺点,27,传统的农残化学分析主要是气相或液相色谱等仪器 优点：敏感(10l2 106 molL) 、准确 缺点：操作复杂、费时及成本高。 难以满足需求 怎么办？ 发展适合我国的快速检测技术,28,生化检测生物检测化学比色法,二、适合我国的农药残留快速检测方法,酶抑制法,免疫分析法,发光菌检测法,敏感家蝇检测法,速测卡,速测仪,主要为酶免疫法,29,酶抑制法,酶抑制技术是研

10、究比较成熟、应用最广 泛快速的农药残留检测技术，是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE)的特异性生化反应建立起来的农药残留的微量和痕量快速检测技术。,30,1、速测卡法,1）原理：,速测卡（即纸片，固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片） 浸提液（ pH7.5缓冲溶液，15.0g Na2HPO412H2O+1.59g KH2PO4 ，用500 mL蒸馏水溶解）仪 器（常量天平，有条件时配备372恒温装置，专为速测卡 法而设计的“农药残留速测仪”和超声波提取器）,2）、试剂及仪器,3）、检测流程,整体测定法 选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方片，取5g放入带盖

11、瓶中，加入10ml浸提液，震摇50次，静置2min以上（超声波提取中震荡30秒）。（采样-样本制备- 样本前处理） 取一片速测卡，在白色药片上滴上23滴提取液。（加样） 在37温度中放置10min（有条件时在恒温装置中放置），预反应后的药片表面必须保持湿润。（预反应） 将速测卡对折，用手捏3min， 使红色药片和白色药片叠合反应。（速测卡反应） 每批测定应设一个缓冲液的空白对照。 有条件时，将纸片插入“农药残留速测仪”自动恒温、定时观察。,4)、检测方法（整体测定法、表面测定法）,表面测定法（粗筛法） 选取有代表性的蔬菜样品，擦去蔬菜表面泥土，滴23滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻

12、摩擦。 取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。 、 步骤同上。,36,速测卡检测结果,“-”阴性（蓝色） “+”弱阳性（淡蓝） “+”强阳性（白色）,干扰物质的排除 葱、蒜、萝卜、芹菜及番茄汁液，含叶绿素较高的蔬菜，不要剪得太碎。测定番茄时，可将提取液放在茄蒂处浸泡2min，取浸泡液测定。测定韭菜或大蒜时，可整根或整粒放入容器中，加入提取液后振摇提取测定。,6)、操作要点,空白对照卡不变色原因：药片表面浸提液少、表面不够湿润，和/或是温度太低。反应时间和温度的控制当T37，酶反应的时间相对延长 。 样品放置时间应与空白对照卡放置时间一致（可比性）叠合反应的时间 3min( 3min后的蓝

13、色加深，24h后退色）,6)、操作要点,速测卡技术指标,符合率 据报道，在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱验证，阳性结果的符合率在80%以上。检出限 速测卡法检测常见农药的检出限与国家允许蔬菜中最大残留限量（mg/kg）比较。（附表）,附：速测卡对几种常用农药的最低检出限 与最大残留限量比较（mg/kg）,41,2、速测仪,原理:在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。 用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷

14、或氨基甲酸酯类农药的存在。,42,农药残留快速测试仪,43,速测仪检测结果,抑制率与农药残留量成正相关，抑制率越高说明残留量越高,44,免疫分析技术,免疫分析技术是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量分析技术，是基于抗原抗体特异性结合和反应为基础的分析方法。目前应用于农残检测的是酶免疫分析(EIA)和放射性免疫分析(RIA)。其中酶联免疫分析技术应用最为普遍。,45,3、酶联免疫技术 ELISA是一种以酶作为标记物的免疫分析方法，也是目前应用最广泛的免疫分析方法之一，它将酶标记在抗体抗原分子上形成酶标抗体酶标抗原，酶作用于能呈现出颜色的底物，通过仪器或肉眼进行辨别。,46,ELISA法

15、基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。该法因不需昂贵仪器设备，对人体无害等优点而被广泛采用，具有灵敏、特异、快速、稳定以及易于自动化操作等特点。,47,目前，ELISA方法常用的固相载体是96孔聚苯乙烯酶标板，常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的底物是邻苯二胺和四甲基联苯胺等。,酶标板 u型 96孔,48,4、发光菌检测法,农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，通过细菌发光情况，可测出农药残留量。 此方法简便但是特异性差,49,5、敏感家蝇检测法,敏感家蝇对杀虫剂具有敏感性，记录家蝇存活情况，根据家蝇的死亡率可知农药残留情况。该技术方法直

16、接、过程简单、容易掌握，但定性粗糙，只对少数农药有效，而且由于其他生物对不同农药的毒性反应与人畜可能不同，因此影响对农药残留量的判断。如家蝇对毒性较低的除虫菊酯类敏感，远超过有机磷和氨基甲酸酯类中毒或高毒的农药。,目前常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸，两者都是利用迅速产生明显颜色的化学反应检测待测物质，可通过与标准比色卡比较进行目视定性或半定量分析。,6、化学比色法,51,化学比色分析法与一般的仪器分析方法相比，具有价格低，操作相对简便，结果显示直观，一次性使用，不需检修维护，有一定的灵敏度和专一性等优点。随着检测仪器的不断发展，与其相配套的微型检测仪器也相应出现。如与试剂检测方法相配套

17、的微型光电比色计目前已发展得比较成熟。,52,三、农药残留快速检测技术展望,一些快速速检测方法与国家标准方法和仪器法相比具有操作简单、快速的优点，但由于大多数快速检测方法在食品样品前处理、操作规范性方面还有许多待完善之处，目前还只能作为快速筛选的手段而不能作为最终诊断的依据，兼具快速和准确两大优点是快速检测方法追求的目标。,农药快速检测技术,第二节 兽药残留快速检测技术,1、兽药的概念：兽药是用于预防、治疗、诊断动物疾病的药物或者有目的地调节动物生理机能的物质（含动物保健品和动物饲料添加剂）。兽药的主要用途是防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等,一、兽药残留与食品安全意义,

18、2、兽药的种类,以下6种兽药不能长期应用，否则易超过动物食品张兽药限量：呋喃唑酮（痢特灵）磺胺类喹乙醇氯霉素土霉素硫酸庆大霉素,3、兽药残留,兽药残留：根据联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）食品中兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母体化合物或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。,兽药残留形式：原药、药物在体内的代谢产物、共价结合物,兽药残留主要是由于不合理使用药物治疗疾病和作为饲料添加剂而引起。在兽药品应用方面，用于饲料添加剂占46%，治疗药品占43%，疫苗等生物药品占11%。我国滥用和超标使用兽药尤其是抗生素和激素类药物的状况是十分严重的

19、。,3、兽药残留现状,肉蛋奶的安全成问题,我国兽药残留安全问题,“瘦肉精”（盐酸克伦特罗）中毒事件鲜牛奶中抗生素残留 进出口贸易受挫,全球禁止，不得检出,1、“瘦肉精”中毒,在养殖业中常见使用的激素类，也叫盐酸克伦特罗,2001年央视新闻头条，屡禁不止,瘦肉精中毒的临床表现为心动过速，面颈、四肢肌肉颤抖，头晕、头疼、恶心、呕吐，特别是对患有高血压、心脏病的病人，可能会加重病情导致意外。因此，全球禁止将其作为饲料添加剂。,2、鲜牛奶中抗生素残留,国家质检总局的一条消息频繁见诸媒体：一项对中国北方市场的检测调查结果显示，在近800份乳品采样中，抗生素残留超标居不合格项目第一位，其次是汞和铅超标。,

20、奶粉、奶片、冰激凌等奶制品生产原则是一般不用好奶。,思考：为什么酸奶都是无抗奶？,购买伊利、光明等生产厂家推出的无抗奶。,担心有抗奶，就喝酸奶。,2002年，外经贸部收到驻欧使团经商处的特级报告：欧盟委员会拟讨论通过全面禁止从中国进口所有动物源性产品的决议。 由于欧盟的禁令，美国、日本等国已高度关注我国出口水产品的质量。,3、进出口贸易受挫,谁来解决我放心吃鱼虾的问题,进出口贸易受挫,据悉，自从一九八六年欧盟严格执行肉类食品法规以来，中国的猪肉就基本上无法进入欧盟市场；日本则根据国际流行病疫情报告，把中国列入“三类地区”，从此中国的猪、羊、牛肉也基本上无法进入日本市场。,随着我国加入WTO，我

21、国畜产品在国际贸易中将面临更加激烈的竞争环境，药物残留往往是引发国际贸易中非贸易性技术壁垒障碍的导火线。,欧盟以氯霉素残留超标为由暂停中国蜂蜜进口案,我国年产蜂蜜约20万吨、蜂王浆1 000吨，年创汇1亿多美元，蜂群数量和主要蜂产品出口均居世界第一，其中欧洲一直是我国蜂蜜出口的主要市场。由于“抗生素超标”，我国蜂蜜在国际市场上的价格和数量优势丧失殆尽，大批已经出口至欧洲国家的蜂蜜惨遭退货，我国蜂蜜出口由此受到严重影响。据天津口岸2002年第一季度的数据显示，与2001年3月同期相比，蜂蜜的整体出口总量下降了70， 出口总值下降了65.4。,因氯霉素结构中的硝基苯根能抑制血细胞线粒体蛋白质的合成

22、，导致线粒体的损坏。如果使用氯霉素不当，将会引起再生障碍性贫血 。,饲用含兽药的饲料及饲料添加剂不恰当用药随意加大药物用量用药错误或未做用药记录没有按规定执行应有的休药期使用未经批准的或禁用的兽药屠宰前使用兽药（通常屠宰前10天要禁药）食品加工过程受到污染（如食品保鲜）,4、兽药残留的来源 （以抗生素残留为代表）,禽畜末次给药到允许屠宰或它们的产品（乳蛋等）许可上市的间隔时间，通常47天。,5、兽药残留的危害 （以抗生素残留为代表）,毒性作用过敏反应和变态反应细菌耐药性菌群失调 “三致”作用激素的副作用造成经济损失,6、兽药残留的控制,有效的监督管理和检测体系建设加强药物的合理使用规范严厉查处

23、违禁药物用作饲料添加剂谨慎使用抗生素饲料生产过程中药物添加剂污染的控制：药物添加剂型选择、药物添加的管理、加工和设备清洗、标签严格规定休药期和指定动物性食品药物的最高残留限量（MRL）,在消费环节没有很好的办法去除残留在动物性食品中的兽药,兽药最高残留限量(MRL)动物用药后产生的允许存在于食品表面或内部的改兽药残留的最高量。 (单位gkg，以鲜重计)。,二、食品中兽药残留控制及其分析,为有效控制兽药残留，各国都制定了兽药使用的法律与法规及使用的有关标准。休药期：是指动物从停止给药到许可屠宰或它们的乳、蛋等产品许可上市的间隔时间。奶废弃期：即奶牛从停止给药到它们所产的奶许可上市的间隔时间。,兽

24、药残留分析技术的特点待测物质浓度低样品基质复杂，干扰物质多兽药残留代谢产物多样或不明动物种类多样，对药物代谢存在差异,对检测方法的要求快速高通量(high throughput)定量准确度和精确度(accuracy & precision)确证(unequinocal identification)法定的和QC,食品兽药残留的传统检测分析方法GC-MSLC-MS,耗时长、设备昂贵、试剂消耗量大，不易推广。,高通量、低成本、快速敏感性好、再现性好、操作容易、不需昂贵的仪器。,筛选方法：微生物法、免疫化学方法（ELISA）等确证方法：HPLC、GC、GC-MS、LC-MS、 LC-MS-MS,理想

25、的仪器装备样品经简单处理即可上机测定不需萃取和净化快速、准确的定量分析自动的资料处理,食品中兽药残留快速筛选检测常用方法：微生物法免疫法色谱法,抗生素种类繁多，结构复杂，测定方法各不相同。因而给检测工作带来了许多困难。抗生素的测定方法进展很快。,三、食品中抗生素残留快速检测方法,微生物法、免疫法、理化仪器法是食品中抗生素残留检测常用的3种方法,二、食品中抗生素残留检测方法,微生物法如“TTC试验”基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留。以扩散过程或浑浊度为基础。抗生素浓度越高，微生物的生长受抑制程度越大，菌落越小。微生物法试剂盒：分析样品数量、操作

26、便捷、灵敏度高、条件要求低适合：养殖场、食品加工车间,（1）平皿法以抑菌区域为检测指标,动物源性食品抗生素类药物残留检测,用尺子测量从棉试子边缘到抑菌圈边缘的距离，样品周围有大于2毫米的抑菌区域证明阳性（含有抗生素）；没有抑菌区域表明样品为阴性。,先枯草杆菌悬液放于培养皿中，再将样品接种到培养皿，在恒温箱中培养1624h,培养基I,培养基II,阴性,最低检测限,阳性,其他药物残留,（2）生化检测法牛乳等液体样品主要利用培养基pH等因素改变引起指示剂颜色变化的生物化学原理来指示检测结果.检测法/试剂盒：TTC、Delvotest、Charm Science等。,鲜乳中抗生素残留量的测定（TTC试

27、验）,（一）原理 当乳中含有抗生素时，标准菌株嗜热链球菌的生长受到抑制，不能将指示剂2,3,5氯化三苯基四氮唑（TTC）还原为无色。反之，当乳中抗生素不存在时，加入的标准菌株，就会大量生长繁殖，而且将TTC还原为红色化合物。其红色强度与细菌数量成正比。 本法对各种抗生素的最低检出量：青霉素为0.004IU/mL，链霉素为0.5IU/mL，庆大霉素为0.4IU/mL,TTC法为鲜乳中抗菌药物残留检测的标准方法。,2，3，5氯化三苯四氮唑试验（TTC试验）,嗜热乳酸链球菌,（二）注意事项 1.本法的正确性与菌种的活力有密切关系。如菌种活力减弱时，应多次反复传代加强活力。 2.每次检验每个样品应一式

28、二份，另外要作阴性、阳性对照各2管，阴性对照管作无抗生素乳9mL，阳性对照管用无抗生素乳9mL加抗生素。 3.水浴培养要避光，保持37，水面高于被检样品，判断要迅速；检样经80水浴加热5min，要严格掌握。 4.制备培养基的乳要绝对无抗生素存在；操作所用试管、吸管均须经灭菌。,89,四环素类抗生素残留量的测定,食品中四环素类抗生素的测定多采用微生物法原理 样品经提取，用离子交换树脂分离，甲醇溶剂洗脱，经浓缩，残渣用Mcllvaine缓冲液溶解，经荧光鉴定，然后用微生物法进行定量测定。本方法的最低检出量为0.05mg/kg。,90,其它抗生素也可用此法进行测定，只是试验的菌种不同或培养基不同。

29、测定青霉素为金黄色葡萄球菌，链霉素或双氢链霉素为枯草杆菌（6633），氯霉素为卵黄色八叠球菌（9341），新生霉素为白色葡萄球菌。,2、免疫检验法,通过检测食品中的抗抗生素抗体来确定抗生素含量。基于抗生素（抗原）刺激动物产生相应的应急反应，从而形成抗体。优点：操作简单，速度快、取样量小，前处理简单、容量大，仪器化程度低，灵敏度高，适用于现场监控和大量样品的筛选，具有广阔的应用前景缺点：直接测定存在样本信息量太少，假阳性和理化分析技术选择性低，当样品中含有与某类抗生素结构相似的化合物时，可能出现免疫交叉反应而呈现假阳性结果,免疫学方法快速检测放射免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析发光免疫分析胶体金

30、免疫分析,兽药残留免疫学快速检测方法的建立重要包括：检测对象的选择检测对象结构分析免疫半抗原的合成人工结合抗原的制备与鉴定抗体的制备检测方法的确立与方法评价等。,1、药物结构分析和半抗原的合成兽药多为小分子化合物（分子量小于5000Da），不具备免疫原性，需先和大分子载体偶联后方可用于抗体的生产。多数情况下，检测对象的结构不适合用于直接和蛋白质等载体直接偶联，需要进行抗原改造。半抗原改造的原则：和载体偶联后可以最大限度地暴露原药物的结构特征。,2、人工结合抗原的制备通过选择小分子半抗原中的活性基团或者改造后加入的活性基团，选择适当的偶联试剂、载体蛋白和连接条件进行人工结合抗原的制备。,3、抗体

31、的制备多克隆抗体动物免疫、抗体纯化、鉴定高度异质性，不同个体产生的抗体成分不同单克隆抗体动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞株的建立、抗体的生产及鉴定永续性、高度均一性,4、检测方法的建立胶体金免疫层析法（速测卡、胶体金试纸条、速测试纸条）酶联免疫吸附测定法放射免疫及荧光免疫测定法生物感应器,主要由两个元件组成：生物学识别元件（通常是一个抗体）；信号转换元件连接着数据采集和处理系统的精密接触元件。分析靶标与生物受体(抗体）结合产生信号，该信号被不同原理的传感器转换成电子信号，然后被计算机等处理成最后的结果。,3、理化仪器分析方法,常用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）对抗生素进行定量、定性的测定

32、，主要是基于它们测定痕量物质的优越性。,优点：分离速度快、效率高和操作可自动化，已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。目前，HPLC方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。,央视每周质量报告播出315特别节目“健美猪”真相,盐酸克伦特罗检测卡,克伦特罗为白色结晶粉末，易溶于水、醇类、微溶于氯仿。作用机理：克伦特罗选择性作用于动物-肾上腺素能受体，激活腺甘酸环化酶，使环磷酸苷(cAMP)增加，加强脂肪分解，促进蛋白质合成，实现动物营养再分配，可提高动物的瘦肉率。,克伦特罗,-受体,酶,ATP,cAMP,脂肪分解蛋白合成,营养再分配提高瘦肉率,在畜牧业生产中一些非法使用者将其

33、作为一种生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质；同时也造成动物性食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。当人们食用含有盐酸克伦特罗（瘦肉精）残留的产品后会产生一定的中毒症状。,克伦特罗的毒性,心血管系统：心悸、心慌、头晕头痛等临床症状 神经系统恶心、呕吐、肌肉疼痛、肌肉颤抖、兴奋、不自主地颤抖、运动障碍禁忌症 心脏病、糖尿病、高血压、青光眼、甲亢,中 毒 剂 量,人医用药量： 0.02 0.5 g/kg中毒一般含量： 肝脏 100 500 g/kg中毒极端含量： 肝脏 19 5395 g/kg,以克伦特罗快速检测, 金标（胶体金）快速检测试纸 金标（胶体金）快速检测卡,金标试纸,金标检测卡

34、,金标检测技术的基本原理,金标免疫检测试纸条系统使用一种特殊的多孔膜（NC膜）作为固相载体。该膜具有很强的蛋白吸附功能，抗体抗原吸附于NC膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应标记了胶体金的抗原抗体快速结合。 在湿润状态下，液相中的抗原抗体免疫金可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相另一抗原决定簇单抗结合，形成特异的金标记抗体抗原抗体红色沉积线，表现出抗原抗体的特征反应。,BSA偶联的克伦特罗分子与胶体金颗粒结合，包被在玻纤上,标记抗原的金颗粒,在纤维素膜上分别将克伦特罗抗体和BSA抗体分别包被在检测区（T）和质控区（C）,抗体,试剂条组装,被标记的金颗粒,样品垫,滤纸,抗体,加入样

35、品,样品流动,试剂条检测,样品中没有克伦特罗时：,金颗粒上的克伦特罗抗原和纤维素膜上抗体的结合，检测区T线显示红色。,样品中有高浓度的克伦特罗（ 3ppb ）时：,由于样品中克伦特罗的分子与金颗粒上克伦特罗抗原竞争与纤维素膜上的抗体结合，当样本中克伦特罗浓度较高，胶体金偶联物不能与克伦特罗抗体结合，T线不显色；当样本中克伦特罗低于一定值，T线紫红色线条。,T线,C线,这样，在高浓度的情况下，即使T线不出现，只要C 线出现，就知道试剂没有问题。而如果连C线都没有，则可知道是试剂有问题，该包装的试剂应该弃用。这样就避免了假阳性的结果。,3ppb,1ppb,0.5ppb,0ppb,阳性,阴性,金标卡

36、检测操作与注意事项,1）.检测准备 （1）准备： 试剂盒 尿 样 记录本 记号笔 计时器,操作步骤,（2）打开试剂盒,（3）阅读说明书,（1）取出检测卡：根据检测样品数量确定需要的检测卡数量,2）.操作,（2）检测卡放置：在平坦的台面上,（3）检测卡标记（必要时）：标记上尿样编号,2）.操作,（4）吸取尿样：用试剂盒带的滴管吸取尿样,（5）滴加尿样：滴管垂直滴加2滴尿样于加样孔（S）中,（6）观察结果：肉眼观察紫红条带的出现，测试结果应在5min时读取,2）.操作,3）.结果判定,阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色带，在测试区（T）内无紫红色条带出现。表明尿液中的克伦特罗残留物大于3pp

37、b。阴性（-）：两条紫红色条出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区内（C）。表明尿液中不含克伦特罗残留物或小于3ppb。,无效：质控区（C）未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的检测卡重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。,未加样前 阴性 阳性 无效,2.2. 注意事项,1）.存储与使用（1）储存：室温（2-40）阴凉干燥处，忌冷冻。（2）使用：室温（2-40）使用，检测卡取出20min内使用，避免受潮失效。（3）反应：检测卡避免阳光直射、空调或风扇直吹。,注意事项,2）.操作过程（1）检

38、测卡放置：放置于水平的台面上，忌倾斜。（2）加样：尿样加入加样孔中，不要加入检测区；垂直滴加2滴尿样，不要整管加入（3）结果判读：测试结果在5min时判读,注意事项,3）.样品准备一般澄清尿样可直接用于检测，较为浑浊尿样建议离心或过滤后用于检测4）.包装袋使用未用完检测卡的包装袋要确认封口密封，以免产品受潮,无效结果与可能原因,无效结果,正常结果,阳性 阴性 白板 无C线 出线淡 不跑板,可能原因1.包装袋密封不好，产品受潮2.检测卡未水平放置3.尿样加入检测区4.尿样加样量太多或太少5.不洁净尿样，如含有漂白粉、明矾，或浑浊尿样6.检测环境温度过低7. 产品过期8.其他原因,盐酸克伦特罗检测

39、卡适用于猪肉、内脏、猪尿液中国盐酸克伦特罗含量的检测；灵敏度（阈值）：不同规格3ng/ml(kg)、 5ng/ml(kg) 、 6ng/ml(kg)等针对猪组织和尿液采样不同类型的检测卡，使用时应区别使用；肉及内脏中脂肪会导致假阳性结果，取样时需剔除肉眼可见的脂肪；检测卡应在在常温下使用，不用对刚屠宰或冷冻猪肉直接进行检测；自来水、蒸馏水或去离子水不能作为阴性对照，可用阈值接近的几个浓度阶梯来校验检测卡的灵敏度。,莱克多巴胺检测卡,氯霉素检测卡,牛乳中青霉素酶活检测试剂盒,适用范围：检测牛乳中残留的青霉素酶检测原理：采用间接竞争法，利用青霉素酶可分解牛奶样品中的-内酰胺类抗生素的原理，通过配体

40、-受体识别法快速测定与青霉素酶反应后残留的青霉素G的含量，从而检测牛奶样品中残留的青霉素酶。本试剂盒一个小时内便可检测到牛奶样品中残留的青霉素酶，在403温育45分钟后，极低浓度的青霉素酶便可以催化水解4ppb的青霉素G。,试剂盒组成：青霉素酶活性检测试剂盒所含有的试剂： 含有特定浓度青霉素G的玻璃试剂瓶； 试剂筒（包括8孔微孔试剂和8条测试条） 微量移液器配套吸头96支 阴性质控（不含抗生素和酶的原奶干粉），浅绿色,操作要点：吸取400l牛奶样品加到含有一定浓度青霉素G的玻璃试剂瓶中，混合均匀403温育45分钟吸取200l温育后牛奶样品加到装有冻干试剂的微孔中，混合均匀403温育3分钟测试条

41、插入到微孔中403下继续温育3分钟判读结果,整个检测过程分为三个步骤，需下面三个要素：1. 将待测牛奶样品加入到含有一定浓度青霉素G的玻璃试剂瓶中于403温育45分钟。2. 在第二个403温育3分钟过程中，未被分解的青霉素G会与金颗粒标记的青霉素受体结合。3. 在第三个403温育3分钟过程中，在测试条的检测线（T线）处可以检测到剩余的青霉素受体。,结果判定：阳性（+）:如果牛奶样品中含青霉素酶，不能抑制青霉素受体与俘获带的结合，所以在测试条上检测线（T线)会出现红色条带，而控制线（C线）区会出现浅红色条带。阴性（-）：如果牛奶样品中没有掺杂青霉素酶，或者青霉素酶含量少于可检测到的范围，玻璃瓶中

42、的青霉素G会与青霉素受体结合，从而将会抑制青霉素受体与俘获带的结合，所以在测试条上只有控制线（C线）区一个条带显色。,126,三、食品中激素的测定,由于动物性食品中性激素的含量极微，所以一般的测定方法受到了限制，较常用的方法有薄层色谱法、荧光分析法、气相色谱法和高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法具有更大的优越性，并有取代其它方法之势。 （一）、性激素总量的测定（薄层色谱法） 1、原理 样品中的性激素经有机溶剂提取、浓缩，在硅胶G薄层板上点样、展开后，以硫酸显色，与标准斑点进行比较，从而达到定性和半定量的目的。,127,2、注意事项 1）.薄层色谱法可用于性激素的鉴别、半定量测定以及含量测定前

43、的分离。 2）.由于性激素的种类多，故所用的溶剂系统、吸附剂、展开剂和显色剂不能一概而论。可根据具体情况，挑选效果最佳者使用。,128,（二）、雌激素残留量的测定（包括己烯雌酚的测定）（荧光分光光度法),1、荧光分光光度法 1）. 原理 样品中雌激素经盐酸水解为甾体缀合物，用有机溶剂提取后，再经硫酸处理，在紫外光照射下，产生蓝色荧光；其激发波长542nm，发射波长560nm，根据荧光强度，可测定雌激素的含量。,129,2）. 注意事项 (1)本法测定的是雌激素的总量，包括雌酮、雌二醇和雌三醇。 (2)操作过程中加入氢醌，可防止荧光产物氧化，增进荧光的稳定性；二氯甲烷溶剂中加入对硝基苯酚也起增进

44、荧光稳定性的作用。 (3)因为雌激素有酚羟基存在而呈弱酸性，用碳酸氢钠缓冲液（pH 10.5）洗涤，可将那些强酸性物质洗掉。,130,(4)测定中用NaOH振摇，可使雌激素转入NaOH 液层，而中性甾体仍留在有机相中，起到清除杂质的作用。 (5)在作乙醚提取之前，加入固体碳酸氢钠调节pH至10，是乙醚定量提出雌激素的关键。,131,2、液相色谱法,1）.原理 试样匀浆后，以甲醇提取过滤，注入HPLC柱中，以紫外检测器鉴定。于波长230nm处测定吸光度，同条件下绘制工作曲线，己烯雌酚含量与吸光度值在一定浓度范围内成正比，试样与工作曲线比较定量。本法适用于新鲜鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉中己烯雌酚残留量的测定。,132,2）.分析步骤 （1）提取及净化：甲醇 （2）色谱条件 （3）绘制标准曲线 （4）测定,133,3. 注意事项 （1）对主要影响因素甲醇、磷酸二氢钠、pH采用正交试验选择最佳实验条件。 （2）本法采用两次提取（甲醇），离心、过滤，回收率高，但灵敏度不太高。 （3）使用流动相时，预先进行超声波脱气，以防气泡堵塞色谱柱。,134,THE END ！,