膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件.ppt

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1、膜片钳技术,泰山医学院脑科研究所 2014.3,1991 Nobel基金会的颁奖评语：,膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。,细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动,细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。,磷脂双层的屏蔽作用,离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度

2、或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.,Na-K 泵,K+o Na+i,离子通道 (ion channels),离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（

3、K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。 特性：通透性（permeation） 选择性（selectivity） 门控性（gating） 研究技术： 膜片钳技术和分子克隆技术,一、离子选择性(selectivity )（大小和电荷）： 某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：KNa 100倍、兴奋： NaK 10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)： 失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。,离子通道的特性(Cha

4、racteristic of Ion Channels),离子通道的功能(Function of Ion Channels),1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、学习和记忆3.维持细胞正常形态和功能完整性,膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多疾病有关，某些先天性与后天获得性疾病是离子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子通道病 (ionchannelpathies)。,配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和氨基丁酸受体,乙酰胆碱受体,电压门控通道：钾、钠、钙离子通道,电压门控钾离子通道,环核苷酸门控通道

5、气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon,电生理学研究简史：,二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有

6、电流存在。1912年，Bridge 确定了AP的“全或无”现象。同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel奖。,1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1m的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。Voltage clamp（电压钳技术）由Cole和Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了HH模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。,1948

7、年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位；1969年，又证实NM接触后的Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10100 G的高阻封接(giga seal)，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。,1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时

8、发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了“通道”的概念。1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patch clamp)技术。1983年10月，Single-Channel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。1991年， Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。,History of Ion Channel Study,赫克斯利Andrew Fielding Huxley英国英国伦敦大学1917年-,196

9、3年诺贝尔生理学/医学奖发现了神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑制有关的离子机制,艾克尔斯Sir John Carew Eccles澳大利亚澳大利亚国家大学1903年-1997年,霍奇金Alan Lloyd Hodgkin英国英国剑桥大学1914年-1998年,离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得阿格雷和罗德里克麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的离子通道药理学和H

10、ill的 Ionic Channels Of Excitable Membranes .,离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术电压钳(Voltage clamp)技术膜片钳(patch clamp)技术,电压钳技术(Voltage Clamp)：电压钳技术，是20世纪初由Cole发明， Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测

11、定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa= INa/ （Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na, k ,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子

12、通道的的研究做出了极大的贡献。,电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使VmVc, Vc与V

13、m的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。,电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。 3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在1030m

14、之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是608OM或120150M（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1s）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力,膜片钳技术,膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流， 从而了解离子运输、信号传递等信息。,基本原理,利用负反馈电子线路

15、,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。,膜片钳（patch clamp）,内尔(Neher) 萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。,膜片钳,研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约1 m)

16、与细胞膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞方式。 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。,膜片钳放大器的工作模式：(1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是膜片钳的基本工作模式.(2).电流钳模式:向细胞内注入刺激电流，记录膜

17、电位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，EPSP;IPSP等电压信号。,膜片钳,为了记录到膜电位，电极尖端必须与要记录细胞的细胞膜形成紧密的封接，故又称紧密封接。电压钳位(tight-seal voltage clamp )，这种紧密封接可使电阻达到千兆欧(10 9)级，故称为“千兆欧封接”( gigaseals ),膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10 ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。,膜片钳技术的优点,膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，

18、相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。,膜片钳记录方法按照微电极尖端是吸住细胞膜不损伤它，还是吸出细胞膜片，或按吸出的细胞膜片是原来胞质侧还是细胞外侧暴露在浸泡液中，可将膜片钳技术分为4类， 即细胞附着膜片(cell-attached patch )、全细胞记录(whole-cell recording、外膜外向(outside-out )和内膜外向(inside-out)膜片技术。,细胞贴附式,全细胞记录式,外面向外式,内面向外式,膜片钳的几种记录模式极其形成：,各种记录模式的形成过程,a,膜片钳使

19、用的标本 1.单细胞：急性分散细胞和培养细胞2.脑片或组织块。3.整体动物。要求：膜片钳80%的工夫在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。,脑片,单细胞,膜片钳记录的信息,电压钳模式,电流钳模式,1.单通道电流,1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。他有两个电导水平，即0和1，分别对应通道的关闭和开放状态。2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通道所形成的电流台阶，从而可推断出被测膜片的通道数目。3.有的通道可记录到圆滑型和方波形两种形式。4.有些通道开放活动是持续开

20、放，中间被闪动样的关闭所中断，形成burst开放。有些通道开放活动是簇状开放与短期平静交替出现，形成簇状发放串（Cluster),2. 全细胞电流,全细胞电流是一些形状各异的电流曲线,5.mEPSC,4.sEPSC、mEPSC,突触电流,3.Glu受体电流,6.神经元动作电位,膜片钳技术,一、记录设备 首先，尽可能完善膜片钳记录设备是实验前的重要步骤，如用模型细胞测定电子设备、安装并测试应用软件、调节光学显微镜、检验防震工作台等。二、微电极的制备 膜片钳电极是用外径为1-2mm的毛细玻璃管拉制成的。标准的毛细玻璃管(外经1. 5mm，管壁厚0.3mm)适合于制作单通道记录的微电极，而全细胞记录

21、则应选管壁较薄(0.16mm)的毛细玻璃管，这样可以使电极阻抗较低。,膜片钳技术,三、封接(sealing)技术 封接(seal)是膜片钳记录的关键步骤之一。封接不好噪声太大必然影响细胞膜电信号的记录，一般要求封接阻抗至少20G才可进行常规记录。为了形成良好封接必须保持清洁的溶液、良好的视野以及适当的电极镀膜。 为了获得较好的“千兆欧封接”，细胞表面必须裸露以便微电极尖端能接触细胞，细胞的大小也是成功记录的一个因素，一般选择10-20um的细胞比较理想。,膜片钳技术,全细胞膜片钳记录(whole-cell patch-clamp recording)是应用最早，也是最广的钳位技术，它相当于连续

22、的单电极电压钳位记录，也就是说全细胞记录类似于传统的细胞内记录，但它具有更大的优越性，如高分辨率、低噪声、极好的稳定性以及能控制细胞内的成分等。全细胞记录技术测定的是一个细胞内全部激活通道的电流， 记录过程中电极的溶液取代了原细胞质的成分。虽然膜片钳记录技术与最初的单电极电压钳位相比进步了很多，尤其在单离子通道钳位记录方面，细胞或脑片的组织选择及实验溶液的制备仍然是很重要的步骤。,膜片钳技术,实验溶液 浸溶细胞溶液和微电极玻璃管内的填充液成分对全细胞膜片钳记录也是很重要的内容，这关系到封接的容易程度、细胞存活状态及膜电位的状态等。 在实验记录过程中，尤其是神经生物学实验，需要迅速更换细胞浸溶液

23、浓度以免受体敏感性降低(desensitization)或需要模拟快速突触反应的寿命。原则上细胞的浸溶液成分或玻璃管内填充液成分应该与细胞外或细胞内间质的成分相似，实际研究中，为了探讨某些通道或电位特性，对这些实验溶液的成分或浓度会作必要调整，没有哪种溶液是绝对理想的。,膜片钳技术的建立,1.抛光及填充好玻璃管微电极，并将它固定在电极夹持器中。2.通过一个与电极夹持器连接的导管给微电极内一个压力，一直到电极浸入记录槽溶液中。3.当电极浸没在溶液中时给电极一个测定脉冲(命令电压，如5-10ms, 10mV)读出电流，按照欧姆定律计算电阻。4.通过膜片钳放大器的控制键将微电极尖端的连接电位(jun

24、ction potentials)调至零位，这种电位差是由于电极内填充溶液与浸浴液不同离子成分的迁移造成的。,膜片钳技术的建立,5.用微操纵器将微电极尖端在直视下靠近要记录的细胞表面，并观察电流的变化，直至阻抗达到1G以上形成“千兆封接”。6.调整静息膜电位到期望的钳位电压的水平，使放大器从“搜寻”转到“电压钳”时细胞不至于钳位到零。 7.把膜电位钳位电压调到-80- -100mV , 再用钳位放大器的控制键把全细胞瞬态充电电流调定至零位(EPC-10的控制键称为C-slow和C-series ; Axopatch 200标为全细胞电容和系列电阻)。,膜片钳技术的建立,8. 写下细胞的电容值C

25、c和未补整的系列电阻值Rs，用于消除全细胞瞬态电流，计算钳位的固定时间(即RsCc)，然后根据欧姆定律从测定脉冲电流的振幅算出细胞的电阻Rc。9. 缓慢调节Rs旋钮注意测定脉冲反应的变化，逐渐增加补整的比例。如果Rs补整非常接近振荡的阈值，Rs或Cc的微细变化都会达到震荡的阈值，产生电压的振荡而使细胞受损。因此应当在Rs补整水平与不稳定阈值之间留有10%-20%的余地最为安全。10.准备资料收集和脉冲序列的测定。,资料分析,一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通

26、道的时间依赖性失活、开放与关闭类型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭(flickering)，化学门控性通道的开、关速率常数等。 药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。 综合分析得出最后结沦,膜片钳实验室基本设备,膜片钳放大器信号转换器倒置显微镜微操纵器防震工作台及静电屏蔽笼微电极拉制仪及抛光仪计算机专用软件细胞记录槽恒速灌流泵,电子学部件：由于膜片钳检测的是PA级的微电流信号，因此需要特殊的放大器及模数转换器，目前国内使用的主流放大器主要是美国AXON公司的200B和Multiclamp700B放大器及德国HEKA公司的EPC10放大器。 2

27、00B是电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳，Multiclamp700B和EPC10可通过软件进行操作，自动化程度高。,200B,P-2000,P-97,Sutter公司微电极拉制器,日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪,机械系统:由于膜片钳实验是一个微电和微操作实验，任何微小的震动都会影响电极和细胞的封接，导致实验的失败，因此一台高质量的防震台是必须的。,软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处理软件，如Origin等软件。,MDC公司Pclamp采集和分析软件,膜片钳

28、技术的发展：全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）的出现标志着膜片钳技术已经发展到了一个崭新阶段，从这个意义上说，前面所讲的膜片钳技术我们称之为传统膜片钳技术（Traditional patch clamp technique），传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，

29、免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！全自动膜片钳技术采用的标本必须是悬浮细胞，像脑片这类标本无法采用。此外，全自动膜片钳技术只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式以及细胞贴附式单通道记录模式，而不能进行其他模式的记录。不同的全自动膜片钳技术所采用的原理也不完全相同，大体上有如下几种：,1. Flip-Tip翻转技术：将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，打破露在玻璃电极尖端开口外的细胞膜就形成了全细胞记录模式。德国Flyion公司的Flyscreen 8500系统采用的就

30、是这一技术，其通量最高为6，即一次可同时记录6个细胞。它的显著特点是：（1）仍然采用玻璃毛坯作为电极；（2）药物施加微量、快速。,Automatic Patch Clamp Robot,原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制。芯片上有约1m的孔，从芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。,2. SealChip技术：完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2m的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国Axon（MDS）公司的PatchXpress

31、7000A系统是高通量全自动膜片钳技术的典范，是离子通道药物研发的革命性工具，在国外实验室和制药厂广泛用于hERG通道药理学的研究。其通量最高为16，即一次可同时记录16个细胞。同时，其药物施加微量、快速，不仅用于药物筛选，还大量用于离子通道的基础研究,此外，同SealChip技术一样采用平面电极芯片，但只含有一个封接孔的小型全自动膜片钳设备也已经问世。这种小型设备代替了显微镜、防震台/屏蔽网和微操纵器，一次只记录一个细胞。虽然通量不高，但是由于封接破、膜等过程为自动化，工作效率也有显著提高。德国Nanion公司的Port-a-Patch就是这样的全自动膜片钳设备。,过去认为，膜片钳只能在培养

32、细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（Slice patch），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。,组织切片膜片钳技术（Slice patch）,1992年，在脑片膜片钳技术上，美国Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。1993年，德国的Dodt和Sakmann合作，利用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录不但能够在神经元胞体及其树突

33、上进行，而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳记录。,组织切片膜片钳技术（Slice patch）,Neher等首创将膜片钳技术与Fura 2 荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。Neher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,进而可以定量研究钙离子浓度与分泌率的关系及最大分泌率等指标。,膜片钳技术与其它技术相结合,他又创膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用的技术。之后又将光电联合检测技术与碳纤电极电化学检测技术首先结合起来。这种结合

34、既能研究分泌机制,又能鉴别分泌物质,还能互相弥补各单种方法的不足。Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用,可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术,膜通道蛋白重建技术。,膜片钳技术的应用膜片钳如今已成为基础医学和临床医学的常用研究手段，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 以下结合我们的工作，介绍一些应用实例。,膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外

35、)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。,细胞特性的研究：细胞的基本特性包括被动膜特性如膜静息电位、膜电阻、膜电容、膜时间常数等。而对于可兴奋细胞还包括细胞的主动膜特性如动作电位的形式、阈值、幅度、频率等.这些指标往往反映细胞的成熟程度，处于不同发育时期的细胞这些指标往往是有差别的。这为我们进行某些疾病的细胞移植治疗的细胞选择提供了一些参考指标。例如，骨髓问充质干细胞(MSCs)具有多向分

36、化的潜能，在体外培养可向心肌细胞分化，目前的研究认为MSCs是干细胞移植治疗心肌梗死的理想细胞资源 。 MSCs移植治疗心肌梗死能使心功能得到改善，但同时也可能发生心律失常。因此，明确这类MSCs在移植前具有怎样的细胞特性及其发育过程，对移植细胞的选取和干细胞移植后电生理研究具有重要意义，我们的研究发现， MSCs培养4周后其细胞特性比较接近于正常的心肌细胞，因此，笔者认为若以未诱导分化的MSCs做移植，培养4周左右(446代)的细胞不失为良好的细胞选择。而MSCs钾离子电流表达的不均一性或许是导致心律失常产生的原因之一。,离子通道的鉴别： 利用膜片钳技术可对细胞表达的离子通道进行定性和定量分

37、析，这为我们明确某些细胞的电生理特性提供了基础。近年来，神经干细胞已成为一个研究热点，神经干细胞研究的目的就是应用它结构与功能可塑的特征来修复发生损伤或退行性病变的中枢神经系统。对正在分化的神经元细胞系的定性研究表明形态学的发育与功能的成熟并不是完全很好的相关。如果仅通过定性分析就假定神经干细胞来源的神经元和神经胶质细胞是充分分化和有功能的，而无电生理或其他功能性方面的研究证据， 那么这种研究是很难令人信服的，因此，功能性的成熟尤为重要。我们对培养的新生大鼠海马干细胞分化的神经元的电生理特征进行了初步的探讨，结果证实：海马干细胞分化的神经元可表达瞬时外向钾电流（IA）；延迟整流钾电流（IK）：

38、钙电流（Ica);钠电流及NMDA受体电流，并可产生动作电位，这说明海马干细胞分化的神经元具有神经元的初步的电生理特征，但与原代培养的海马神经元相比无论是其各种通道表达的数量还是动作电位的特征均存在明显差别，表明其电生理特征尚不成熟。如何使其成为具有成熟电生理特征的神经元将是下一步研究的重点。,电压门控性离子通道的动力学特性研究:细胞正常功能的维持有赖于各种离子通道数量的平衡表达和功能的精细调节，离子通道存在激活门和失活门两个门，这就决定了离子通道存在激活、关闭和失活三种状态，对这三种状态的动力学过程的研究对揭示电压门控性离子通道的功能特点有重要意义，一些疾病或一些临床药物正是通过对上述动力学

39、过程的影响来发挥作用的。例如SO2是一种常见的全球性大气环境污染物， SO2代谢衍生物可剂量依赖性地增大钠电流,剂量为10和100mol/L时,钠电流分别增大50.5919.08%和82.0618.51%(n=15);此外还与电压呈依赖性关系,但不具有频率依赖性; 10mol/L SO2代谢衍生物不影响钠电流的激活过程,却非常显著地影响其失活过程,作用前后的半数失活电压分别为-69.714.67和-53.274.95 mV (n=10,P0.01),但不改变失活曲线的斜率因子。实验结果提示, SO2衍生物具有类似神经毒物的作用。,突触联系、突触传递的研究：突触后电流是神经元之间是否形成突触联系

40、的特异性电生理指标。神经干细胞移植已成为修复损伤或退行性病变的中枢神经系统的新的治疗手段，移植的干细胞要发挥治疗作用最根本的是要能和其他的正常的神经元发生功能性的联系。通过突触素及电镜的观察表明，神经干细胞和原代培养神经元体外共培养，二者能发生形态上的突触连接，通过记录突触后电流，证实二者也能发生功能性的联系，至于干细胞体内移植，他和其他神经元能否发生功能性的突触连接有待进一步研究。,1. 突触可塑、学习记忆及其机制的研究： 长时程增强（LTP）是评价学习记忆的及其突触可塑的常用的电生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛用于学习记忆方面的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学

41、习记忆的机制。许多学者从不同方面对突触LTP与学习记忆的关系进行了大量的研究，其结果大致可概括为，一些影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响，一些影响学习过程的因素也影响LTP形成。诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴有海马脑区LTP的形成。丙戊酸钠是常用的抗癫痫药，但近年来发现其损伤患者的学习记忆功能。我们观察了丙戊酸钠对大鼠海马LTP的影响及其作用机制。初步表明丙戊酸钠对LTP的影响是通过突触前机制起作用。,膜片钳在药理学研究中的应用,膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革命性意义，而且开辟了一条探索药物作用机制和发展新的更为有

42、效药物的途径。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路” 。,对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究,通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑损害过程中，Ca2+ 介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载，导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神经元坏死。,对药物作用机制的研究,在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位

43、（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。,在心血管药理研究中的应用,随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而

44、且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。,创新药物研究与高通量筛选,在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。,新药开发,在现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创制的前提。随着膜片钳技术运用对许多新受体亚型的发现和特性研究，新型受体阻断剂将在选择性 、高效性上发

45、挥更大的作用。,近十年来药物学研究最重要的成就之一就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和维拉帕米及其衍生物) 。研制出钾通道开放剂（nicorandil、pinacidil等） 类抗心律失常新药是近年来心血管药理的重要研究方向 。,离子通道病及与离子通道调节缺陷有关 疾病的研究。将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。,疾病机制研究： 离子通道结构和功能的异常可导致离子通道病，人类许多疾病都是由于各种离子通道的功能障碍所造成的，常常累及人体多个系统，目前已经发现至少有

46、几十种离子通道参与离子通道疾病的发生，根据病因，大致可分为几类：,（1）离子通道基因编码区突变，导致离子通道功能亢进或降低：如癫痫是由于患者脑组织病灶中的神经元同时去极化，产生高频、同步、爆发式放电并向周围扩散，导致更广泛的脑组织兴奋，引起癫痫发作。研究发现，高热惊厥癫痫综合症患者的第19号染色体上的基因发生了突变，而这个突变的基因正是电压依赖性钠通道1亚基的基因。1亚基调节通道的开关速率，突变导致亚基上的一个氨基酸发生了改变，使钠通道的开关速率变慢，神经元的去极化时间延长，钠依赖性动作电位不断形成引发癫痫。,（2）通道调节能力缺陷：如细胞内钙在淋巴细胞的增殖、分化、IL-2的分泌及受体的表达

47、等方面起作重要作用，淋巴细胞膜上K（Ca）通道对细胞内钙的调节起作重要作用，研究表明，K通道阻断剂阻断此通道后，淋巴细胞的分裂增殖及IL-2的合成明显受到抑制。K（Ca）开放引起大量K外流，使细胞膜超级化，对Ca离子内流的驱动力增大，使Cai增加， Cai又使K（Ca）通道活化，导致Cai增加。,（3）产生自身抗体：如重症肌无力，是一种神经肌肉终板部位突触后膜上AChR减少而出现传递障碍的自身免疫性疾病，有家族史，与遗传密切相关。骨骼肌细胞AChR通道出现抗体，导致AChR功能障碍，以骨骼肌的渐进性疲劳和延及全身的虚弱为特点。,（4）形成新的离子通道而产生疾病：如B淀粉样蛋白可在神经元膜上形成大的非选择性离子通道，该通道可通透Ca离子，这可能是老年性痴呆疾病中神经原受损的原因之一。,