园艺植物组织培养第4章ppt课件.ppt

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1、第四章 愈伤组织的形成和植株再生,成熟细胞,脱分化细胞,再分化,器官,胚状体,愈伤组织,植物的再分化形式有两种，器官发生型和胚胎发生型，在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。,4.1.1 愈伤组织形成的条件,4.1 愈伤组织的形成,离体:与植株分离，从其它组织与器官的抑制中解脱出来。,合适的培养条件： 大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件

2、，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型和外植物体原来在植株上所处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。,外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期诱导期分裂期形成期,4.1.2 愈伤组织形成的过程,诱导期：细胞分裂的准备期,诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。,诱导期的长短，因植物种类和

3、外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。,分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期,分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，分裂期主要表现如下：,1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。,2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。,3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。4细胞的核和核仁增大到最大。5.随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和

4、核酸含量大大增加，新 的细胞壁的合成极快。总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。,形成期：从愈伤组织到器官发生,形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。,进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。,分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但

5、不形成维管系统。,此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。,以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。另外，有一些研究者曾反复指出的，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。,1 愈伤组织的生长,一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。,4.1.3愈伤组织增殖的方

6、式,外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。,2 愈伤组织的继代培养,脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。,通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。,烟草愈伤组织在8周培养期间形态的变化,A是与琼脂培养基垂直方向的切面

7、,B是与琼脂培养基平行方向的切面,一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。,4.1.4 愈伤组织的状态及其调控,来源于不同植物或同一植物不同部位的愈伤组织,在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，如颜色黄或白；外观光滑或粗糙；结构致密或松脆；遗传生理功能有胚性或无胚性。,1 优良愈伤组织的特性,（优良的愈伤组织通常应具备以下4个特性中的2-3个特性）,旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。,高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。,

8、容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。,经过长期继代保存而不丧失胚性，方便对它们进行各种遗传操作。,2. 愈伤组织的类型,主要根据对小麦、高粱和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织的研究，王海波将愈伤组织分为3种主要类型：,类型：保守分裂型，结构致密，生长较慢，容易分化成苗,类型：亢进分裂型，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增 殖很快,类型：衰败型，结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡,注意：1. 在这3种类型之间还存在许多过渡类型。 2. 类型和类型之间在一定程度上可以相互转变， 衰变型细胞在一定程度上也可以得到控制。,能够促进这种转变和控制的因子有几种，其

9、中最主要的是植物激素和氮源形态。,氮源除了供给培养物氮素营养外，氨态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂的效果不明显时，增加培养基中的氨态氮可起到明显的促进分裂的作用；当使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂的抑制效果不显著时，增加培养基中的硝态氮或减少氨态氮，可起到显著的抑制分裂的作用。,致密愈伤组织（A）与疏松愈伤组织（B） 细胞结构的比较1.巨大细胞；2.管状细胞；3.细胞间隙,3 愈伤组织状态的调控,（1）选择适当的基因型和适当的外植体,虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同

10、，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。,基因型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。,器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。,年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。 如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈向上部，苗的分化频率

11、越高。因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。,2. 选择正确的培养基,培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。,3. 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。加入一些常规培养基中不用的物质和条件。,4.2 器官分化,愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。,形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、再分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。,在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构

12、组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。,4.2.1 器官发生,概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。,发生方式：有两种发生方式,（1）直接发生：外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）,（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。,在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种途径：,1器官发生途径 通过茎芽的分化

13、形成不定芽实现，指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。,器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种：,（1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；,（2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；,（3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。,颠茄悬浮培养细胞先分化根后形成芽的过程,2胚状体方式（somatic embryo）,指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。（后一节中介绍）,4.2.2

14、 影响茎芽分化的因素,1 化学因素,主要是激素的种类和浓度。,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,高 有利于根的形成和愈伤组织的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成,生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growth medium is optimised for regen

15、eration of plantlets,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,tissue culture in the African Violet,No sucrose (0%),Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,tissue culture in the African Violet,tissue culture in t

16、he African Violet,Sucrose reduced to 1%,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,tissue culture in the African Violet,Sucrose increased to 5%,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is compara

17、ble with the control medium,tissue culture in the African Violet,No BAP,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,tissue culture in the African Violet,BAP reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced development of roots an

18、d shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,tissue culture in the African Violet,No NAA,Poor shoot development and no roots,tissue culture in the African Violet,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,tissue

19、 culture in the African Violet,Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,NAA increased to 5.0 mg. l-1,tissue culture in the African Violet,No sign of regeneration from explant at all.,No MS salts,tissue culture in the African Violet,Some root

20、growth but reduced development of shoots,MS salts reduced to 0.47 g. l-1,tissue culture in the African Violet,Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,MS salts increased to 9.52 g. l-1,2 物理因素,培养基形式：在固体培养基上，粉蓝烟草郎氏烟草的组织培养物以一种完全无结构的状态生长，但在成分相同的液体培养基中，则能形成茂密的茎芽。,渗透压：在一个双单倍体马铃薯品种

21、叶肉原生质体获得的愈伤组织中，只有在培养基里加入0.2-0.3mol/L甘露醇以使渗透压保持在200-400毫渗透压摩尔时，才可能出现茎芽的分化。否则，愈伤组织不能变绿，而愈伤组织变绿是芽分化的前提。,光强和光质：高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用，天竺葵愈伤组织只有在光照和黑暗交替条件下才能分化茎芽，培养在连续光照下无器官分化。,温度：Skoog 在5-33的范围内研究了温度对烟草愈伤组织分化和生长的影响，发现直到33时愈伤组织的生长都随温度的上升而增加，但只有在18时最适合茎芽的分化，在33时不能形成茎芽。,3 其它因素,培养材料的染色体组,供提植株和外植体的生理状态,外植体的细胞发育

22、状态,培养物的历史和内生激素水平。,4.3 体细胞胚胎发生,4.3.1 体细胞胚胎发生的方式,有两种发生方式,（1）直接发生：从培养的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段。,（2）间接发生：外植体先愈伤化，然后由愈伤组织再分化成胚。,A.由外植体外层细胞直接产生体细胞胚B.由外植体组织内的细胞产生体细胞胚C.愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚,4.3.2 影响体细胞胚胎发生的因素,1生长调节物质,（1）生长素类：,我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析：,在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。,愈伤

23、组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养基（增殖培养基），通常所用的生长素是2，4-D，浓度范围0.51mg/L。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作“胚性细胞团”（CE)。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。,然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。连续保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的“诱导培养基”，而把每个胚性

24、细胞团看成是一个无结构的胚。,野生胡萝卜悬浮培养中体细胞胚胎发生过程的模式图,（2）细胞分裂素类：,细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既可促进也可抑制体细胞胚的发生，这主要取决于植物的种类及其基因型。,一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。,另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为0.1mol/L的玉米素却能促进这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。,（3）赤霉素类： 赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对

25、于许多植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用。,（4）脱落酸： 抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是0.11M）的ABA用于荷兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。,2 氮源,氮源的形态有还原态氮（NH4+）和氧化态氮（NO3）两种。,在以KNO3为唯一氮源（如White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而，若在培养基中加入少量NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态

26、氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。,Reinert及其合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培养基均为White培养基)得到以下结果： NH4+氮（M） NO3氮 （M） 体胚发生数（个/2ml） 10 40 1131219 0 55 0.90.3 0 95 11.34.1 从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。,与KNO3不同，当以NH4Cl为唯一氮源时，只要经常调节pH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与在NH4Cl 和KNO3 最适配比的情况下相当。当只有NH4Cl时，培养基的pH值在4 d之内将

27、有5.4降到43.5，这对胚胎发生是有抑制作用的。 由此看来，还是搭配使用NH4 和NO3较为方便。,3 其它因子,钾离子的浓度:高浓度的钾(20mmolL)是胚胎发生所必须的。,培养基中溶解氧的含量： 应低于一个临界值（1.5mgL）， 否则有利于生根，而不利于成胚。,由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：,4.3.3 体细胞胚胎的成熟过程,1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。,2)胚状体形成 细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的

28、类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。,3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。,在活体和离体条件下胚和茎芽的下端在解剖学上的差别,A、D、F是胚B、C、E是茎芽,胚状体与不定芽的区别,胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：,最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。,胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。,胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。,

29、胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：,如胚状体产生数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。,胚状体与合子胚的比较,体细胞胚常常能在原来的培养基上成熟和萌发。注意：在不经冷处理种子就不能萌发的物种中，幼龄或成熟的胚可能必须先经历一段低温之后才能正常的长成小植株。葡萄体细胞胚：低温处理时期 球形期成熟期均可 低温处理温度 4 2周花菱草体细胞胚低温处理后才能萌发。柑橘属植物草体细胞胚萌发期间，需要使用GA3以促进根和茎的发育。,4.3.4 长期培养物形态发生潜力

30、的丧失,有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至完全损失。为了解释这种现象，现在有三种假说。,1 遗传说 该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。,2 生理说 随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变或是由于对外源生长物质的敏感性发生改变，从而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种

31、分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。,如Fridborg和Eriksson(1975)发现，在含有2，4-D的培养基上培养8周之后，本来具有全能性的胡罗卜培养物完全停止了胚胎发生的过程，然而，向这种培养基中加入14的活性炭之后，丧失了的全能性又可以得以恢复。 在这个培养系统中，胚性潜力的丧失可能是由于内源生长素水平提高所致。,3 竞争说 这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者Smith 和Street（1974）的看法，在胡萝卜细胞长期连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生

32、长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上，Jones（1974）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。,在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。即存在胚性的细胞类型和非胚性的细胞类型 按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步

33、增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。,5.5 人工种子,人工种子（artificial seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。,最早提出人工种子概念的是著名植物组织培养学家Murashige。他于1978年在加

34、拿大召开的第四届国际植物组织细胞培养会议上，首次提出利用植物组织培养中具有体细胞胚胎发生的特点，把胚状体等组织包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能并可直接播种于田间的设想。,按照他的设想，“人工种子，最外面为一层有机的薄膜包裹，起防止水分散失及保护作用。其中含有培养物所需的营养成分和某些植物激素，以作为植物材料萌发时的刺激因素并提供能量，最里面就是被包埋的胚状体或芽体等植物材料。通过这几部分的组合，人为地创造出一种与天然种子相类似的人工合成种子（synthetic seed)，因此又叫人造种子（man made seed.）或无性种子（somatic seed)。,人工种子制作程序：,1.高质量体细胞胚胎发生系统的建立,2.体细胞胚胎发生的同步化控制,3.人造种皮及人造胚乳研制与包埋,4.人工种子的转换（ 体细胞胚胎发育成据正常表现型的绿色植株的能力）,