园艺植物组织培养第12章ppt课件.ppt

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1、12 种质贮存,种质保存的主要目的:最大限度地保持每种物种的遗传多样性。植物的遗传多样性可以表现在物种的水平上，也可以表现在品种和个体的水平上，保存这种多样性的方法有两类：一类是原生境保存（in situ conservation)一类是异生境保存（ex situ conservation),原生境保存是指在自然条件下对传统的地方品种及其野生物种的保存，保存手段主要是建立自然保护区。在保护区内，野生种自我繁衍，并有可能与地方品种天然杂交，从而形成一个植物育种家难以模拟的进化系统。异生境保存则是指人工创造的环境条件下对种子或离体的植物细胞、组织和器官的保存，其中种子保存是种质保存的一种传统方式。

2、,自1975年Henshaw和Morel首次提出离体保存(conservsfion in vitro)植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的高度重视。常用的离体保存方法有组织培养保存法(tissue culture conservation)和超低温保存法(cryopreservation)。前者适合中短期保存，后者用于长期保存。,12.1 组织培养保存法,利用组织培养技术保存种质资源的理论基础是植物细胞具有全能性的学说。该技术只适合于试验材料、育种材料等的短期保存，一般采用正常生长的途径，也就是将带有腋芽的茎段接种在MS半固体培养基上或液体培养基的滤纸上，然后放在2025 的条件下培养，并

3、适时进行继代培养，一般6090 d繁殖一次。按组织培养技术保存种质的原理，可将该保存方法分为常温继代保存法(room temperature subculture conservation)和缓慢生长保存法(slow growth conservation)。,12.1.1 常温继代保存法 指在常温条件下，每隔一段时间，将植物细胞或组织进行新一轮的继代培养，以达到保存种质的目的。洋芋无根试管苗在MS+BA 8 mg/L +NAA 0.2 mg/L +8 g/L 琼脂的培养基中，可在常温下保存370 d，苗存活率达92 。,12.1.2 缓慢生长保存法 缓慢生长保存，是指通过在培养基中加入化学物

4、质或采用一些物理方法，限制或延缓培养物的生长，使组织或细胞的生长速率降至最小限度，但不死亡，从而达到延长继代培养时间的目的。限制细胞生长速度的途径主要有：改变培养物最适生长温度；调整培养基养分水平；应用渗透性化合物或生长抑制剂；降低培养环境中氧含量等。,(1) 降低培养温度 降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最常用的方法。较低温度可以减缓植物的生长速度，在一定温度范围内试管苗的存活率随保存温度的降低而提高，这种方法适合于保存中短期的种质材料。一般用19低温保存外植体，但热带、亚热带植物在1025之下也能延缓外植体的生长。此法已在众多无性繁殖的园艺植物上应用，如葡萄、草莓、苹果和一些茄属植

5、物等。,兰芹英等 (2004)在12、18和24条件下对蒙自凤仙花茎尖进行离体保存，结果表明，蒙自凤仙花茎尖最适保存温度为12，保存1 年后存活率为100；刘月学等 (2004)研究了低温条件下枇杷试管苗离体保存的效果，结果表明，在低温条件下，枇杷试管苗生长缓慢，保存时间较长，在11和15条件下，品种“解放钟”和“早钟6号”1 年后的死亡率分别为20、25和15、20。,(2) 调整培养基养分水平 植物生长发育状况依赖于外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。通过调整培养基的养分水分，可有效限制细胞生长，使培养植物处于最小生长阶段，也称“饥饿法”。Zee和Munekata(1

6、992)在无菌水、完全MS及14 MS等几种培养基中保存菠萝试管苗，结果显示在无菌水中保存1 年后，81的植株仍保持活力，且比保存在完全的MS培养基中的试管苗活力强，在14 MS培养基中保持菠萝试管苗效果最好，存活率及再生率都达到100；,铁皮石斛试管苗接种在MS、1/2 MS和14 MS培养基上，在低温下保存80 d后发现，MS培养基上的植株生长势最旺，但根少而短，保存1 年后，情况发生了变化，MS培养基保存效果最差，存活率只有41.67，而14MS和I/2MS培养基上的存活率分别为91.67和100；咖啡分生组织培养的小植株在无蔗糖的l/2MS培养基上，可保存22.5 年。,（3） 添加化

7、学物质 试验表明，完善和调整培养基中的生长调节剂配比，特别是添加生长抑制物质，利用激素调控技术，不仅能延长培养物在试管中的保存时间，而且能提高试管苗素质和移植成活率。目前，常用的生长抑制物质种类有CCC、B9 、PP333、S3307、ABA、TIBA、膦甘酸、甲基丁二酸等。,在Ms+IBA 0.984molL-1培养基中添加0.21628.8molL-1 浓度的PP333，可使甘薯品种“徐薯18”试管苗在常温下保存1 年以上，外源赤霉素能消除甘薯试管苗的多效唑处理后效应，0.2890.434molL-1l浓度的赤霉素可使保存后的甘薯试管苗生长量恢复到正常水平。,在室温(1030)条件下，含有

8、0.1 ugg-1ABA的Ms培养基可以有效地减少猕猴桃试管苗继代培养的次数，延长保存时间，随着ABA浓度的增加和保存时间的延长，猕猴桃试管苗丙二醛含量积累，超氧化物歧化酶活性下降 ；适宜含量的脱落酸也具有延缓葡萄试管苗的生长效果，可用于葡萄试管苗的常温保存，延长转接时间。,在培养基中添加一些高渗化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等，也是一种常用的缓慢生长保存手段。对蒙自凤仙花茎尖的离体保存研究结果表明，添加15甘露醇的Ms培养基对茎尖的生长有抑制作用，甘露醇最适浓度为3，保存1 年后存活率为100 ；但权银等 (1996)发现用高浓度甘露醇取代蔗糖不利于柑桔种质的离体保存，培养物用蔗糖保存1 年

9、后的成活率为60 70。而用2甘露醇取代蔗糖的处理，其成活率仅为50。,在培养基中同时添加不同的化学物质，也可达到较好的保存效果。铁皮石斛试管苗在l/2 MS+0.5 mg/LNAA+20 mg/L 蔗糖+0.5 g/L 活性炭+7g/ L 琼脂的培养基上，连续保存l 年，存活率达100 ；马铃薯茎尖在含有脱落酸和甘露醇或山梨醇的培养基上保存l 年后，生长很健壮，转移到MS培养基上生长正常 。,（4） 降低培养环境中氧含量 降低培养环境中氧气浓度或培养基中氧分压，抑制外植体的细胞生理活动，减慢培养材料的生长速度，也可以达到种质保存的目的。最简单的方法是在保存材料上加盖一层如液态石油、石蜡等物质

10、，从而使其氧气量降低 。Bridge和Staby (1981)首次采用降低培养物周围的氧含量来保存烟草、菊花的小植株，保存42d后取出，其整个生长发育过程中没有发生变化；,Dorion (1994)的研究表明，桃的茎尖在低氧(0.20 0.25)条件下保存l2 年，不仅全部成活，而且后期再生能力强，但是如果氧的含量降得过低，则其生长速度下降，并导致毒害。因此，有关低氧对离体保存的影响还有待研究。,12.2 超低温保存法,超低温保存是指在一80(干冰温度)到-196(液氮温度)甚至更低温度下保存生物材料，是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法，它是将低温生物学和微型繁殖(Micropropag

11、ation)相结合的一种新型的离体保存技术(或称细胞工程技术) 。,12.2.1超低温保存方法,植物细胞对低温的敏感性因物种不同而有很大变化，因此找不到一种方法可以普遍适用。一般有以下几种方法：,（1）慢冷法 先把材料以0.54/min的冷却速度由0冷却到-100，然后转入液氮。这个方法对于悬浮培养的细胞特别有效 。,（2）快冷法 Seibert(1976)首先证实，在-196下保存了2个月的察香石竹离体茎尖能够发育成完整的植株。他的做法是，先把液氮直接倾注到装有材料的小玻璃瓶上，然后再把小玻璃瓶放人一个装满了液氮的容器中。在这个方法中，由-10到-70之间的冷却速度大于1 000 /min。

12、后来，Seibert和Wetherbee(1977)又报道，对这种材料来说，最好的冷却速度是50/min。,（3）分步冷冻法 这种方法结合了慢冷法和快冷法二者的优点，先把材料分步冷却（(1-5/min）到一个适宜的中间温度（-30一一50)，在这个温度下停留约30 min,然后再投人到液氮中快速冷却。已经证明这个方法对于茎尖和芽的冷冻保存最为有效。草毒茎尖经超速冷却后存活率为40-60，但若采用分步冷冻法，存活率可提高到60-80%。此外，分步冷冻法对于悬浮培养的细胞也同样有效。,（4）干冻法 据报道，凡是在烘箱中或真空下经过干燥脱水的材料，都有显著的抗冻害能力。众所周知，未发芽的干种子能忍受

13、极低的温度，而吸水之后则容易发生冻害。同样，当把豌豆幼苗置于2729的烘箱中，使其含水量由7277下降到27-40时，浸人液氮后则可全部免遭冻死。根据Withers(1979)的报道，若是用真空干燥法使细胞脱水，植物器官在经受一196冷冻之后存活的情况更好。 最适的脱水程度在不同物种和不同组织中可能是不同的。,（5） 玻璃化法 所谓“玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度，而被固化成玻璃态(或非晶态)，并以这种玻璃态在低温下保存。与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法操作简单、重演性好，避免了

14、一些种质的冷敏感问题，并且在复杂的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力。但是玻璃化溶液对细胞具有一定的毒性，复温后其残余会造成再培养过程中一部分细胞的死亡。,12.2.2 影响超低温保存的因素,影响植物种质超低温保存效果的因素很多，任何一个环节处理不当，均可能导致整个系统的失败。主要因素包括：,（1） 植物材料的特性 植物材料基因型的差异及培养物所处的发育时期和生理状态不同，保存的效果也不同。一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小型细胞抗冻力强。茎尖生长点、愈伤组织等培养物解冻后，只有具上述特性的细胞才能存活，否则细胞会受到伤害。较大的材料如茎尖、胚或试管苗，由于高度液泡化的细胞

15、易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。在超低温保存苹果茎尖时，发现材料的生理状态对保存结果的影响甚至比其它因素更重要 。,（2） 冷冻前的预处理 预处理是改善材料生理状态的有效方法，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强植物的抗冻力，在预培养基中补充甘露醇、山梨醇、脯氨酸等渗透剂，对提高细胞的耐冻力有明显的作用。,（3） 冰冻保护剂 冰冻保护剂可以促使结冰早期各阶段进行保护性脱水，降低冰点和水的过饱和点，阻止冰晶生长。冰冻保护剂多是低分子的中性溶质，易溶于水，处理时对细胞没有或很少毒害，进人细胞迅速且便于冲洗。常用的有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类、乙二醇、

16、脯氨酸、聚乙二醇等。已经证明DMSO是很有效的冰冻保护剂。,使用混合保护剂比单独使用效果更佳，其优越性在于各种成分之间具有协同效应和累加效应(毒性不累加)。马锋旺等以DMSO与山梨醇或葡萄糖混合处理杏愈伤组织，效果明显好于单独使用DMSO；在超低温保存杏原生质体时，获得同样的结果。加入冰冻保护剂应在低温下进行，高温会增加冰冻保护剂的毒害作用。至于采用何种保护剂，必须综合考虑材料的种类和生理状态。,12.2.3 超低温保存的材料,自Nag和Street (1973)首次成功地超低温保存了胡萝卜的悬浮细胞以来，超低温保存技术日趋完善。到目前为止，利用超低温保存的植物材料涉及到细胞(悬浮细胞)、原生

17、质体、愈伤组织、分生组织(茎尖)、芽、花粉、胚或体胚、种子等，大部分已成功地实现了植株再生。,（1） 种子的超低温保存 刘燕等 (2001)对l8个科47种花卉种子进行了超低温保存研究，认为花卉种子在自然含水量状态即可存于液氮(LN)中，超低温保存对一些花卉种子萌发表现出促进作用；通过控制芝麻种子的含水量和冷冻速率，Stanwood (1987)成功地保存了芝麻种子，超低温保存后存活率可达80以上。,（2） 芽及茎尖分生组织的超低温保存 芽的超低温保存是保存无性繁殖植物种质的方便途径。章志宏等 (2000)对水稻单倍体不定芽的超低温保存进行了研究，发现经继代培养的不定芽超低温保存后的存活率为2

18、l 29，再生出苗率为14 18，而未经继代培养的不定芽超低温保存后的存活率仅为8，且均不能再生成苗；Yakuwa H和Oka S (1988)报道，桑树芽经液氮保存后，能够再生正常植株。,茎尖分生组织作为种质超低温保存的材料，具有许多独特的优越性如茎尖分生组织在遗传上更稳定，具有更快的营养繁殖方式，能产生无病植株并且可经受突然的冷冻 。因此，茎尖离体培养不仅逐渐发展成为农作物无性系的繁殖和脱毒的重要手段，而且是超低温保存植物种质的理想材料和可靠的途径，还可借此建立无病毒的种质库。,（3） 花粉的超低温保存 超低温保存花粉可延长花粉寿命，解决花期不育和异地植物的杂交因难，减少病虫害传播。建立起

19、花粉种质库，可以为国际间的种质交换提供便利。王家福等 (2004)采用花粉干冻法对枇杷花粉超低温保存进行了研究，结果表明，脱水至30左右的含水量能够保证超低温保存后花粉的生活力，解冻温度及方式对超低温保存后花粉的生活力没有明显的影响；,玉米自交系“黄早四”和“郑1142”的花粉在超低温(-196)保存12 年后，冷冻花粉的过氧化物酶同工酶图谱类型没有发生变化，冷冻保存的“郑1142”花粉授粉后所产生的种子的过氧化物酶同工酶和可溶蛋白电泳图谱没有发生变化，并且其花粉母细胞减数分裂时染色体数目和结构均属正常，保持了原自交系的特征。,（4） 幼胚及胚状体的超低温保存 幼胚诱导形成愈伤组织的分化能力很

20、强。陈礼光等 ( 2001)对锥栗种子离体胚的超低温保存进行了研究，结果表明，锥栗种子离体胚含水量为20时，其冻后脱氢酶活性最高；黄纯农等 (1992)研究了大麦幼胚的超低温保存，认为山梨醇预培养2 d可提高大麦幼胚的存活率，4 预处理4 h对胚存活率的影响不大，但它使幼胚分化能力下降，冻后幼胚经过恢复培养，可长出绿苗。,（5） 愈伤组织及悬浮培养细胞的超低温保存 愈伤组织和悬浮培养细胞也可进行超低温保存。胡明珏等 (2004)报道了拟南芥悬浮细胞系的玻璃化法超低温，指出冻后细胞能恢复生长，恢复生长的细胞能够保持植株再生能力；陈勇等 (2004)对瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存进行了研究，指

21、出瓯柑愈伤组织在液氮中保存24 h后，用TIE法检测，其存活率可达85.62，冻后的愈伤组织转移到Ms+6-BA 0.5mg/L 继代培养基上，存活率可达76.32；,（6） 原生质体的超低温保存 原生质体具有多种用途，特别是在开辟作物育种新途径方面有着广阔的应用前景。它是进行细胞杂交和基因工程的基础材料，也是进行植物生理学和植物病理学研究的良好的实验体系，对原生质体进行超低温保存的初步研究结果表明，这种保存不仅是必要的，而且冷冻原生质体优于冷冻细胞，由于原生质体没有细胞壁，排除了冷冻期间细胞中产生的张力，所以受伤害较少，存活率提高，同时能筛选出抗逆性强、生长处于优势的细胞系。但原生质体的超低温保存由于操作复杂、技术难度大，故成功的例子不多。,马锋旺等(1998)研究发现，不同品种和不同供体材料的原生质体超低温保存的效果不同，“龙王帽”杏悬浮培养物分离的原生质体超低温保存后的成活率可达40，保存后成活的原生质体分裂频率和植板率均有所提高。,