试验九免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架ppt课件.ppt

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1、免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架,实验九,实验目的与要求,掌握免疫荧光技术的基本原理;了解免疫荧光技术在生命科学中的广泛应用.,一、实验的基本原理,荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。 荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,三、试剂与器材,人肿瘤细胞涂片甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、 FITC标记的I

2、gG、甘油/PBS封片剂、盖玻片荧光显微镜,玻片细胞置于甲醇中-10固定5min，室温凉干（或冷丙酮固定5min，室温凉干）；PBS漂洗2min3次；3% H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶活性）；PBS漂洗5min3次；10%正常羊血清封闭液（0.1M PBS配制）室温封闭20min；弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）；,四、实验步骤,用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200）37孵育1h（或4孵育过夜）；PBS漂洗5min3次；用适当比例稀释的二抗（FITC标记的IgG）（一般稀释比为1:100-1:200，用加有BSA的TBST配制）室温孵育30min（避光黑暗条件下进行）；PBS漂洗5min3次；甘油/PBS封片剂（PBS: 甘油=1：9，v/v，pH8.0-8.5）封片；荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照。,五、注意事项1. 注意各级抗体浓度的使用范围;2. 荧光抗体孵育时要注意避光;3. 注意各步骤的漂洗要充分.,六、作业与思考题试述免疫荧光技术的基本原理,并描述实验中所观察的实验现象.思考题:试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学技术的异同.,